崔廷婷 ，鐘建三 ，張 瑜 ，楊昌松 ，白 莉

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.湖南紅星盛業(yè)食品股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

紅霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，曾廣泛用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1]。但由于該藥物可能通過食物鏈進(jìn)入人體，產(chǎn)生毒副作用[2]，因此，世界各國(guó)對(duì)紅霉素在食品中的殘留限量都進(jìn)行了規(guī)定。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告[3]和歐盟EC1181/2002[4]規(guī)定紅霉素在動(dòng)物組織中的最大殘留限量為200μg/kg。目前，醫(yī)藥領(lǐng)域主要通過分析血液、尿液來測(cè)定人體內(nèi)紅霉素的殘留量[5-6]，食品安全領(lǐng)域主要采用儀器法來分析動(dòng)物源性食品中紅霉素的殘留量，如薄層色譜法[7]、液相色譜法[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-12]等。本試驗(yàn)就使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒測(cè)定了動(dòng)物源性食品中紅霉素的殘留量，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 紅霉素、硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素、泰樂菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈、正己烷、氫氧化鈉、乙酸乙酯、氯化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；紅霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司研制；實(shí)驗(yàn)所用的豬肉、蝦肉、魚肉等樣品均購(gòu)自北京當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備 勻漿機(jī)：上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；電子天平：美國(guó)Setra公司生產(chǎn)；振蕩器：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；氮吹儀：北京金科精華苑科技有限公司生產(chǎn)；微量移液器：美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；生化培養(yǎng)箱：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 豬肉、豬肝、魚肉、蝦肉樣品。稱取1.0g±0.05g均質(zhì)后的樣品至50mL聚苯乙烯離心管中，加入4mL 0.05mol/L氫氧化鈉溶液，用振蕩器劇烈振蕩10min；3000g，室溫（20～25℃）下離心 5min；取 200μL上清液至2mL聚苯乙烯離心管中，加入750μL復(fù)溶工作液，再加入50 μL 0.1 mol/L鹽酸溶液，混勻；從中取50μL用于分析。稀釋25倍。

1.3.2 牛肉樣品。稱取2.0 g±0.05 g均質(zhì)后的牛肉樣品至50 mL聚苯乙烯離心管中；加入10 mL乙腈-0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，用振蕩器劇烈振蕩10min；3000g，室溫（20～25℃）下離心 5min；取 1mL上層液至10mL潔凈干燥玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加?mL正已烷，用漩渦混合器渦動(dòng)30 s；再加入1 mL復(fù)溶工作液，渦動(dòng)30 s；3000g以上，室溫（20～25℃）下離心 5 min；除去上層有機(jī)相，取下層50μL用于分析。稀釋5倍。

1.3.3 蜂蜜樣品。稱取1.0g±0.05g蜂蜜樣品至50mL聚苯乙烯離心管中；加入2 mL甲醇-2%氯化鈉（2∶1混合），用漩渦混合器渦動(dòng)2min至蜂蜜全部溶解；3000g，室溫（20～25℃）下離心 5min；移取 100μL清亮樣品液至2mL聚苯乙烯離心管中，加入900μL復(fù)溶工作液，混勻；從中取50μL用于分析。稀釋20倍。

1.3.4 牛奶樣品。取100 μL鮮牛奶樣品至2 mL聚苯乙烯離心管中；加入900μL復(fù)溶工作液，混勻；取50μL用于分析。稀釋10倍。

1.4 檢測(cè)步驟 向酶標(biāo)板的微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品溶液 50 μL，再加入酶標(biāo)二抗（50 μL/孔），最后加入抗體工作液（50 μL/孔），混勻，37℃避光反應(yīng)40 min；洗滌微孔；加入底物液A液和B液各50μL/孔，混勻，37℃避光反應(yīng)15min，加入終止液50μL/孔，混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定每孔的吸光度值（OD值）。

式中，A為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的吸光度值；A0為0標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值。

以橫坐標(biāo)為紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/L）的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣品的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對(duì)應(yīng)的濃度，再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中紅霉素的實(shí)際濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 按照1.4的步驟操作，分別測(cè)定 0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2μg/L 紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，每個(gè)濃度取兩孔吸光度值的平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。其線性方程y=-0.3551x+0.4703，相關(guān)系數(shù)R2=0.9925，IC50為0.825μg/L。從圖1可知，在0.2～16.2μg/L濃度范圍內(nèi)，紅霉素濃度與OD450之間線性關(guān)系較好，可以確定試劑盒的工作濃度范圍為0.2～16.2μg/L。

2.2 檢測(cè)限 測(cè)定20份空白樣品中紅霉素的含量，檢測(cè)限等于空白樣品測(cè)定均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算結(jié)果見表1。豬肉、豬肝、牛肉、魚肉、蝦肉、蜂蜜和牛奶中紅霉素的檢測(cè)限分別為4.13、8.23、0.78、3.75、7.94、3.09μg/kg和 1.87μg/L。

圖1 紅霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表1 檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果（n＝20） μg/kg

2.3 準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定 以回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）分別表示準(zhǔn)確度和精密度。在空白豬肉、魚肉樣品中添加終濃度為10、20 μg/kg的紅霉素，在空白豬肝、蝦肉樣品中添加終濃度為20、40μg/kg的紅霉素，在空白牛肉樣品中添加2、4 μg/kg的紅霉素，在空白蜂蜜樣品中添加8、16μg/kg的紅霉素，在空白牛奶樣品中添加4、8μg/L的紅霉素，分別制備以上各濃度的樣品10份，用3批不同的試劑盒在不同的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，測(cè)定回收率和變異系數(shù)。

結(jié)果表明，用不同濃度的紅霉素在空白豬肉等樣品中添加，其回收率在69.0%～107.5%范圍內(nèi)，說明試劑盒準(zhǔn)確度較好；批內(nèi)變異系數(shù)為5.7%～11.4%，批間變異系數(shù)為8.7%～14.0%，均小于15%，說明試劑盒精密度（即重復(fù)性）較好。

2.4 交叉反應(yīng) 選擇紅霉素、紅霉素結(jié)構(gòu)類似物和其他藥物，分別配成 0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2μg/L 濃度，測(cè)定各藥物的IC50。

各藥物的交叉反應(yīng)率用以下公式計(jì)算：各藥物的交叉反應(yīng)率（%）＝紅霉素IC50/其他藥物IC50×100%

從表2可知，試劑盒與硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素的交叉反應(yīng)率較高，這與硫氰酸紅霉素是合成紅霉素的初始原料、琥乙紅霉素是紅霉素的乙酰琥珀酸酯有關(guān)；試劑盒與紅霉素的交叉反應(yīng)率為100%，與其他藥物均沒有交叉反應(yīng)，表明試劑盒特異性良好。

3 結(jié)論

本研究采用酶聯(lián)免疫法對(duì)動(dòng)物源性食品中的紅霉素殘留進(jìn)行了檢測(cè)，其在豬肉、豬肝、牛肉、魚肉、蝦肉、蜂蜜和牛奶中的紅霉素檢測(cè)限分別為4.13、8.23、0.78、3.75、7.94、3.09 μg/kg 和 1.87 μg/L；樣品添加回收率范圍為69.0%～107.5%，變異系數(shù)小于15%，檢測(cè)時(shí)間短（55min）；樣本前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，適合于大量樣本中紅霉素殘留量的快速檢測(cè)、篩選，能夠更好地滿足畜禽生產(chǎn)加工企業(yè)、政府監(jiān)管部門的工作需要。目前，酶聯(lián)免疫法屬于初篩方法，對(duì)于陽(yáng)性樣品仍需使用儀器法確證。

表2 交叉反應(yīng)率計(jì)算結(jié)果

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