王曉玲，李亞妮，江 梅，李信民

1.西安市第四醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安710004;2.延安婦幼保健院內(nèi)科;3.西安交通大學醫(yī)學院分子生物學教研室

便秘是由不同病理過程引起的一種復雜臨床癥狀，主要是指排便次數(shù)減少、糞便干結、排便費力等，嚴重影響患者生活質(zhì)量;腸道水代謝紊亂是便秘的主要發(fā)病機制，特別是結腸內(nèi)水轉(zhuǎn)運異常與其有直接關系。水通道蛋白(AQPs)是一個具有跨膜運輸水分子功能的蛋白家族，目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物消化道有9 種AQPs亞型表達，其中AQP1、3、4、8、9 在結腸有表達，與結腸內(nèi)水分的吸收和分泌關系密切，已有研究表明AQP4與水分吸收密切相關，而AQP9 則主要參與水分分泌［1-3］。本實驗通過構建小鼠便秘模型，利用RT-PCR技術對便秘小鼠結腸黏膜AQP4 mRNA、AQP9 mRNA表達情況進行研究，探討其與便秘的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 體質(zhì)量(20 ±2.0)g 的雄性昆明小鼠20 只，由西安交通大學實驗動物中心提供。小鼠隨機分為對照組和便秘組，每組10 只。

1.2 實驗藥品及試劑 復方地芬諾酯片(常州康普藥業(yè)有限公司);阿拉伯樹膠(滄州市康鑫蜂蠟膠業(yè)有限公司);活性炭(西安鑫寶佳業(yè)化工有限公司)。墨汁的配置［4］:稱取阿拉伯樹膠50 g，加水400 ml，煮沸至溶液透明，稱取活性炭25 g 加至上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后加水定容至500 ml 備用。RT-PCR 試劑盒(MBI Fermentas 公司);RNA 提取液Trizol(美國Invitrogen 公司);瓊脂糖(北京奇松生物科技有限公司)DNA marker(上海生物工程技術服務有限公司)。1.3 方法

1.3.1 便秘模型構建:參照文獻［5］，實驗小鼠均單只單籠飼養(yǎng)，實驗前12 h 禁食不禁水，便秘組給予50 mg/kg·BW 的復方地芬諾酯灌胃，陰性對照組給予等量的蒸餾水灌胃。灌胃后小鼠均正常飲食進水，比較對照組與便秘組小鼠首粒排便時間、12 h 內(nèi)排便粒數(shù)和12 h 內(nèi)排便重量，差異有統(tǒng)計學意義，便秘模型制備成功。

1.3.2 取材:實驗小鼠以水合氯醛腹腔麻醉并處死，迅速取升、降結腸組織各1 塊放入EP 管中，置于-85℃冰箱，供反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)使用。

1.3.3 RT-PCR 測定結腸AQP4 mRNA、AQP9 mRNA表達:首先按照Trizol 試劑盒說明書提取標本中的總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。在NCBI 基因庫中分別查出AQP4、AQP9 的基因序列，之后應用Primer 軟件來設計各自的引物序列并由上海生物工程技術服務有限公司合成。選用β-actin 基因為內(nèi)參照引物基因，反應中所用的上游引物為:5＇-CTA CAA TGA GCT GCG＇TGT GCC-3＇，下游引物為5＇-CAG GTC CAG ACG ACG CAG GAT GGC-3＇，擴增產(chǎn)物為:270 bp;AQP4 上游引物為:5＇-GGG TTG GAC CAA TCA TAG GCG CT-3＇，下游引物為:5＇-GCA GGA AAT CTG AGG CCA GTT CTA GG-3＇，擴增產(chǎn)物為:330 bp;AQP9 上 游 引 物 為:5＇-GATGCCTTCTGAGAAGGACA-3＇，下游引物為:5＇-CGATGCTCTTGGTATTGGCT-3＇，擴增產(chǎn)物為:218 bp。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳及半定量分析:取PCR 擴增產(chǎn)物5 μl，置1%瓊脂糖凝膠中，TBE 電泳緩沖液中4 V/cm 電壓電泳60 min，用GDS7500 圖像分析系統(tǒng)(英國UVP 公司)進行密度掃描定量，以AQP4、AQP9 基因與β-actin 比值表示AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 軟件分析，計量資料以s 表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗呈正態(tài)分布，采用兩個獨立樣本t 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

10 只便秘小鼠均造模成功，無小鼠死亡。對照組及便秘組小鼠升、降結腸均有AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 表達;便秘組升結腸中AQP4 mRNA 表達量高于對照組(P ＜0.05)，升結腸中AQP9 mRNA 兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05);便秘組降結腸中AQP9 mRNA 低于對照組(P ＜0.05)，AQP4 mRNA 高于對照組(P ＜0.05，見表1)。

表1 便秘組和對照組升、降結腸AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 的表達量Tab 1 Expression of AQP4 mRNA and AQP9 mRNA in ascending and descending colon of constipation group and normal group

3 討論

便秘是臨床常見的復雜癥狀，按照病因可分為器質(zhì)性便秘和功能性便秘。器質(zhì)性便秘解除病因后便秘癥狀即可緩解;功能性便秘則根據(jù)病理生理學機制又可分為慢傳輸型便秘、出口梗阻型便秘和混合型便秘，其中慢傳輸型便秘在臨床上非常常見，主要指腸道動力降低、腸內(nèi)容物從近端結腸向遠端結腸運動的速度低于正常人，引起腸道水代謝異常，糞便中水分的重吸收增加或分泌減少，導致大便含水量減少，大便干結，排便費力。

AQPs 是與水代謝密切相關的蛋白家族，主要分布在與體液吸收和分泌密切相關的上皮細胞和內(nèi)皮細胞，具有重要的病理生理意義［6-7］。AQP4、AQP9 在結腸均有表達，且其表達細胞有差異，AQP4 主要表達于吸收上皮細胞，而AQP9 主要表達于杯狀細胞，分別參與腸道的吸收和分泌功能［8-9］。

本實驗通過復方地芬諾酯灌胃構建功能性便秘小鼠模型，研究其升、降結腸AQP4 mRNA、AQP9 mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn)對照組及便秘組小鼠升、降結腸均有AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 表達;兩組升結腸AQP4 mRNA 表達量均高于降結腸(P ＜0.01);便秘組升、降結腸AQP4 mRNA 表達量均較正常對照組升高(P ＜0.05)，提示便秘時AQP4 mRNA 表達增加，導致腸道糞便中的水分重吸收增加，糞便中含水量減少，大便干結;便秘組升結腸AQP4 mRNA 升高更為顯著(P ＜0.01)，這與升結腸為結腸水分吸收的主要部位有關。同時我們研究發(fā)現(xiàn)便秘組升、降結腸AQP9 mRNA 表達均較對照組降低，提示便秘時AQP9 mRNA 表達下調(diào)，導致腸道液體分泌減少，大便干結，排便困難;便秘組與對照組比較，升結腸AQP9 mRNA 表達有所下調(diào)，但經(jīng)過統(tǒng)計學分析差異無統(tǒng)計學意義，而降結腸比較，差異有統(tǒng)計學意義，這說明降結腸具有重要的分泌功能。

以上研究提示，AQP4、AQP9 在腸道水代謝中具有重要的病理生理意義，其表達異常與腸道水代謝紊亂性疾病密切相關，進一步明確更多AQPs 與腸道水代謝異常疾病的關系，針對AQPs 的異常表達，研發(fā)相關的靶向藥物有望成為今后治療腸道水代謝紊亂性疾病的方向。

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