蔣曉蕓，戎 蘭，蔣義斌，鐘 良，孫大裕

復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院消化科，上海200042

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，其發(fā)病機(jī)制及病因至今未明。研究表明，許多脂肪細(xì)胞因子是炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)，參與IBD 的發(fā)病，其中脂聯(lián)素(adiponectin)、趨化素(chemerin)、瘦素(leptin)可能發(fā)揮重要作用。本文首次采用丹參多酚酸治療小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，觀察其療效，并研究其對脂肪因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性BALB/C 小鼠30 只，清潔級，購于國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物種子中心上海分中心，6 ～8 周齡，平均體質(zhì)量(21.350 ±1.334)g。分子量5 000 DSS(Sigma 公司，批號:BCBD6951V)。丹參多酚酸鹽注射液由上海綠谷制藥有限公司提供，批號:09118(丹參乙酸鎂含量99.04%)。脂聯(lián)素、趨化素、瘦素酶免試劑盒由RD 公司出品，批號20110601A。XW-80A 旋渦振蕩器(上海青浦瀘西儀器廠)，K10CD 干式恒溫器(杭州藍(lán)焰科技有限公司)，BDC-280e 冷藏冰箱(伊萊克斯，湖南長沙)，1-15K 3K15 低溫冷凍離心機(jī)(美國Sigma)，ZXC 型紫外殺毒車(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)，OlympusBH2 顯微鏡，Nikon 4500 數(shù)碼相機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 造模:每日制備5% DSS 溶液，供對照組外所有小鼠自由飲用，不再予其他飲水，7 d 可造成急性腸炎模型。

1.2.2 小鼠分組及處理:30 只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、丹參多酚酸鹽干預(yù)組，每組10 只。對照組:每天予正常飲水。模型組:造模同時予生理鹽水腹腔注射2 周。丹參多酚酸鹽干預(yù)組:造模同時每日予丹參多酚酸鹽腹腔注射240 mg/kg 2 周。處死前稱重，眼球采血，3 000 r/min 離心，吸取血清后分裝-20 ℃深低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。開腹，取肛門1 cm 處以上病變明顯處組織標(biāo)本(約5 mm×10 mm)，部分予40 g/L 中性甲醛固定，石蠟包埋，切片HE 染色觀察腸黏膜形態(tài)。

1.2.3 觀察:造模過程中觀察小鼠便血情況。

1.2.4 組織病理學(xué)評分:HE 染色切片觀察腸黏膜形態(tài)。評分標(biāo)準(zhǔn)按Coopers HS 組織評分，前3 項(xiàng)評分相加后與第4 項(xiàng)的乘積為組織學(xué)評分。

1.2.5 血清脂聯(lián)素、趨化素、瘦素:取深低溫冰箱凍存?zhèn)溆醚?，按說明書操作，根據(jù)各OD 值，使用計(jì)算機(jī)軟件，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料若為正態(tài)分布且方差齊性，進(jìn)行t 檢驗(yàn)或方差分析，否則進(jìn)行Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀 造模5 d 后，模型組小鼠廣泛肛門部位有血跡，干預(yù)組小鼠部分肛門部位有血跡，正常組無明顯異常。10 d 后除模型組小鼠外，其余小鼠肛門部位血跡逐漸消失。

2.2 體質(zhì)量 對照組、模型組、干預(yù)組小鼠平均體質(zhì)量分別為(26.90 ±0.99)g、(24.80 ±1.62)g、(25.50±1.08)g。各組體質(zhì)量相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 腸黏膜炎癥程度 根據(jù)各組病理評分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，正常組、模型組、干預(yù)組秩均值分別為3. 92、22.67、10.67，模型組炎癥最重，干預(yù)組因劑量炎癥明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，見圖1)。

圖1 各組小鼠腸黏膜病理圖 A:對照組;B:模型組;C:干預(yù)組.Fig 1 Intestinal mucosal pathological picture of each group A:control group;B:model group;C:interventional group

2.4 小鼠血清脂聯(lián)素、趨化素、瘦素水平 模型組趨化素、瘦素均較對照組高(P ＜0.05)，但脂聯(lián)素較對照組低(P ＜0. 05)。干預(yù)組瘦素低于模型組(P ＜0.05)，但趨化素、脂聯(lián)素與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見表1)。

表1 各組小鼠血清脂聯(lián)素、趨化素、瘦素水平(ng/ml)Tab 1 Serum chemerin，leptin，adiponectin of each group(ng/ml)

3 討論

脂肪組織不僅是能量儲存的器官，它還具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、能量代謝及炎癥反應(yīng)的功能。脂肪組織可以分泌多種細(xì)胞因子，與代謝性疾病、心腦血管疾病、骨關(guān)節(jié)及內(nèi)臟炎癥有關(guān)，通稱為脂肪細(xì)胞因子。其中一些可能聯(lián)系著IBD 的發(fā)生發(fā)展，又以針對脂聯(lián)素、趨化素、瘦素的研究居多。趨化素又稱他扎羅汀誘導(dǎo)基因2 或視黃酸受體反應(yīng)蛋白2。作為趨化素R 的天然配體，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。然而，其確切生理作用目前尚不清楚。趨化素可由脂肪組織釋放，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答過程，募集表達(dá)有cMKLRl 的單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞和DC 細(xì)胞通過自分泌或旁分泌途徑作用于受體CMKLRl，通過趨化素/CMKLR1 相互作用實(shí)現(xiàn)對局部炎性反應(yīng)的免疫反應(yīng)［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)IBD 患者血清趨化素升高，尤其在CD 患者中更為明顯，認(rèn)為其可能與IBD 發(fā)病有關(guān)［3-4］。本研究中也觀察到了模型組趨化素較高的情況。

瘦素主要由白色脂肪組織產(chǎn)生，其他組織也可產(chǎn)生，受體亦廣泛分布于各組織中。瘦素可以刺激單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 等細(xì)胞因子并合成一氧化氮;活化T 細(xì)胞、激活腸道上皮NF-κβ 途徑［5］，發(fā)生炎癥部位的腸上皮細(xì)胞還可直接向腸腔釋放瘦素進(jìn)一步直接損傷局部腸道上皮。還能促使多形核細(xì)胞表達(dá)CD11b，同時釋放活性氧［6］。在嚴(yán)重的UC 患者中發(fā)現(xiàn)血清瘦素的升高［7］。本研究也觀察到了類似的現(xiàn)象。而最新的文獻(xiàn)提出瘦素的拮抗劑PG-MLA 在動物實(shí)驗(yàn)中可減輕腸道炎癥水平，減少炎癥因子生成，對結(jié)腸炎有治療作用［8-9］。這些都說明瘦素可能在IBD 的發(fā)生、發(fā)展中起促炎癥反應(yīng)的作用。

脂聯(lián)素也是由白色脂肪組織產(chǎn)生和表達(dá)的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白，最初認(rèn)為與糖代謝、脂代謝及胰島素敏感性有關(guān)。后發(fā)現(xiàn)其可通過抑制巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞的生長、抑制成熟巨噬細(xì)胞的功能等多種途徑參與、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、IBD 等自身免疫疾病有關(guān)［10-11］。Yamamoto等［10］研究顯示，CD 患者炎性腸段附近腸系膜脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA 和蛋白水平的表達(dá)高于對照組。同時其正常的腸系膜脂肪組織釋放的脂聯(lián)素要多于對照組或UC 患者。該研究還發(fā)現(xiàn)同一患者體內(nèi)，有炎癥的腸段脂肪組織中脂聯(lián)素含量也高于無炎癥腸段。Valentini 等［12］卻在IBD 患者中觀察到脂聯(lián)素水平的下降，本實(shí)驗(yàn)中脂聯(lián)素也較正常對照降低。脂聯(lián)素在IBD 致病中所起的作用還存在學(xué)術(shù)爭議。

以丹參乙酸鎂(丹酚酸B 鎂鹽)為主要成分的丹參多酚酸鹽注射液是中國第一個擁有人體藥代動力學(xué)參數(shù)的中醫(yī)藥制劑，是迄今各種丹參制劑中含有效成分最明確、含量高的一個品種，具有抗炎、抗血小板聚集、清除自由基等多種作用。不少臨床研究顯示丹參制劑可調(diào)節(jié)脂肪因子，但目前沒有應(yīng)用于IBD 治療的報(bào)道。我們之前的工作已發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽在一定的劑量下可通過下調(diào)血清IL-6、CD40L/CD40 系統(tǒng)起到治療結(jié)腸炎的作用［13-14］。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽除了減輕腸道炎癥程度之外，還可使血清瘦素水平降低，但對趨化素及ADPN 無明顯影響。丹參多酚酸鹽能調(diào)節(jié)部分血清脂肪因子，也許是其直接調(diào)控CD40L/CD40 炎癥通路外另一方面的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)觀察到模型組的血清趨化素、趨化素、瘦素升高，脂聯(lián)素降低，也有不少文獻(xiàn)得到截然相反的結(jié)論。這可能是由于脂肪因子同時具有抑炎和促炎的作用，在炎癥的不同階段可能扮演著不同的角色。當(dāng)然，人類和動物的機(jī)體也存在許多差異，因此，脂肪因子的意義需要基礎(chǔ)結(jié)合臨床更細(xì)致全面的研究?？傊?，脂肪因子在IBD 中所起的作用非常復(fù)雜，需要更長時間、更深入系統(tǒng)地針對急慢性炎癥不同的情況進(jìn)行研究。

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