糖尿病胃輕癱大鼠模型制作的實(shí)驗(yàn)研究

*通信作者 E-mail:1092175568@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-09-11網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2255.020.html

柏曉輝1， 管志敏1， 潘艷伶2*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)550001； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)科， 貴州 貴陽(yáng)550001)

[摘要]目的： 探討小劑量鏈脲佐菌素注射液(STZ)聯(lián)合高能量飲食法誘導(dǎo)糖尿病胃輕癱(DGP)大鼠模型。方法： 將24只大鼠隨機(jī)均分為正常組和模型組，正常組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠予高脂高糖喂養(yǎng)，模型組大鼠高脂高糖喂養(yǎng)4周后，予1% STZ溶液腹腔注射3次，劑量分別為20、25、35 mg/kg，第3次注射后4周測(cè)大鼠空腹血糖、胃內(nèi)殘留率、血清胃動(dòng)素(MLT)、胃泌素(GAS)，同時(shí)取大鼠胃組織，觀察胃竇平滑肌細(xì)胞。結(jié)果： 模型組大鼠空腹血糖、胃內(nèi)殘留率、MLT、GAS明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組大鼠胃竇平滑肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變較正常組大鼠有明顯差異。結(jié)論： 小劑量STZ聯(lián)合高能量飲食法可成功復(fù)制DGP大鼠模型。

[關(guān)鍵詞]糖尿??； 胃輕癱； 動(dòng)物，模型； 大鼠； 鏈脲佐菌素，小劑量； 高脂高糖食物

[中圖分類號(hào)]R573.9； R587.1

Experimental Study on the Model of Diabetic Gastroparesis Rat

BAI Xiaohui1, GUAN Zhimin1, PAN Yanling2

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,

theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550001,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate the establishment of rat model of diabetic gastroparesis (DGP) by low dose of STZ combined with high energy diet. Methods: Twenty-four rats were randomly divided into normal group and model group, 12 rats in each group. Rats in normal group were fed with common diet while rats in model group were fed with high energy diet. After four weeks of high energy diet feeding, rats in model group received intraperitoneal injection of low dose of STZ solution three times, 20, 25, 35 mg/kg respectively. Four weeks after the third injection, FBG level, the gastric emptying rate, serum MLT, GAS content of rats were detected. And the gastric tissue of rats was taken out to observe morphological changes of gastric smooth muscle cell. Results: The FBG level, gastric emptying rate, serum MLT and GAS content of rats in model group were significantly higher than their counterparts in normal group (P<0.01). The morphological changes of gastric smooth muscle cell in model group were different from those in normal group. Conclusion: Low dose of STZ combined with high energy diet can successfully establish the rat model of DGP.

[Key words] diabetes mellitus; diabetic gastroparesis; animals model; rat; streptozotocin,small dose; high energy diet

隨著糖尿病發(fā)病率的持續(xù)上升[1]，糖尿病胃輕癱(DGP)發(fā)生率也呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)的勢(shì)頭。據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，50%～76%糖尿病患者并發(fā)胃輕癱，特別在晚期糖尿病患者中高達(dá)75%[2-3]。為深入研究本病的防治，建立一種理想的動(dòng)物模型十分必要。本文對(duì)小劑量鏈脲佐菌素注射液(STZ)聯(lián)合高能量飲食法建立大鼠DGP模型進(jìn)行了研究，報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與材料

SPF級(jí)SD大鼠,健康雄性24只，體重(200±20)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(黔)2002-0001。本實(shí)驗(yàn)所用STZ由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，大鼠胃動(dòng)素(motilin，MLT)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠胃泌素(gastrin，GAS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均購(gòu)于昆明騰昆科技有限公司。普通飼料配方：碳水化合物50%，脂肪10%，蛋白質(zhì)20%。高能量飼料配方：碳水化合物61%，脂肪14%，蛋白質(zhì)14%，蔗糖10%，膽固醇1%。

1.2方法

將24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組(12只)、模型組(12只)，正常組予普通飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠予高能量飼料喂養(yǎng)，連續(xù)4周；4周后模型組大鼠經(jīng)腹腔注射0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配制STZ溶液，劑量為20 mg/kg，72 h后尾靜脈取血測(cè)空腹血糖>16.7 mmol/L為模型組[4]。首次造模后12只大鼠空腹血糖均未達(dá)糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，未有死亡；第二次予25 mg/kg劑量腹腔注射STZ溶液，72 h后測(cè)空腹血糖仍未達(dá)標(biāo)(較首次空腹血糖明顯升高)，未有死亡；第3次予35 mg/kg劑量腹腔注射STZ溶液，72 h后測(cè)空腹血糖有11只大鼠血糖達(dá)標(biāo)，1只死亡。正常組經(jīng)腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠隨意飲水。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠前禁食不禁水24 h，處死大鼠30 min前予半固體糊狀物(羥甲基纖維素5 g、奶粉8 g，糖4 g，淀粉4 g，加水125 mL配成約150 g糊狀物)2 mL/只進(jìn)行灌胃；30 min后股動(dòng)脈采血處死大鼠，每只大鼠取血5 mL，標(biāo)本靜置30 min后，以3 000 r/min離心10 min，分離出血清，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)MLT、GAS含量，標(biāo)本處理及操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。處死大鼠后隨即剖腹取胃(將噴門和幽門結(jié)扎后剪斷)，拭凈，稱胃全重，沿胃大彎將其剖開(kāi)，除去胃內(nèi)容物、清洗胃后拭干再稱其重量，測(cè)胃內(nèi)殘留率[5]，胃內(nèi)殘留率=(胃全重-胃凈重)/糊重×100%。取胃竇組織約10 mm×2 mm，放入10%福爾馬林液固定病理切片，觀察胃竇平滑肌細(xì)胞形態(tài)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1造模后空腹血糖、胃內(nèi)殘留率

模型組大鼠造模后空腹血糖及胃內(nèi)殘留率較正常組明顯升高(P<0.01)，證明本實(shí)驗(yàn)復(fù)制DGP大鼠成功。見(jiàn)表1。

表1　兩組大鼠造模后空腹血糖及

(1)與正常組比較，P<0.01

2.2血清MLT、GAS含量

由表2可見(jiàn)，模型組大鼠血清MLT、GAS含量較正常組顯著升高(P<0.01)，通過(guò)胃腸激素水平進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)大鼠DGP模型復(fù)制成功。

表2　兩組大鼠血清MLT及GAS含量比較

(1)與正常組比較，P<0.01

2.3胃竇平滑肌細(xì)胞形態(tài)

正常組大鼠胃竇平滑肌細(xì)胞多呈梭形，細(xì)胞核規(guī)則，呈長(zhǎng)橢圓形，核膜相對(duì)平滑，褶皺少而淺，異染色質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)內(nèi)密斑、密體明顯，肌絲清晰可見(jiàn)。模型組大鼠胃竇平滑肌細(xì)胞變小，細(xì)胞核不規(guī)則、核膜皺縮明顯，染色質(zhì)呈致密塊狀，深染、邊聚，密體、肌絲減少。見(jiàn)圖1。

3討論

2011年全世界糖尿病患者約3.66億人，比2010年增加了0.8億多，提升近30%，統(tǒng)計(jì)當(dāng)年每1 min約有10人死于糖尿病并發(fā)癥[6]。作為糖尿病常見(jiàn)慢性并發(fā)癥之一，DGP不僅能引起病人血糖控制不佳，還可誘發(fā)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)不良及內(nèi)環(huán)境紊亂，導(dǎo)致全身衰竭，加劇病情惡化[7]。 DGP的發(fā)展將嚴(yán)重影響糖尿病其他并發(fā)癥的發(fā)生與進(jìn)展，DGP不僅是患者關(guān)注的焦點(diǎn)，也是醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)，復(fù)制DGP大鼠模型對(duì)研究糖尿病引起的DGP的發(fā)生機(jī)制及有效治療十分重要。

正常組　　　　　　　　　　　　　　　　　模型組 圖1　正常組和模型組大鼠胃竇平滑肌細(xì)胞(HE, ×100) Fig.1　Comparison of morphological changes of smooth muscle cell of sinuses ventriculi

目前，DGP大鼠造模主要有實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)法和自發(fā)性糖尿病模型，因自發(fā)性動(dòng)物模型價(jià)格昂貴，且造模過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)，所需飼養(yǎng)條件及飼料要求嚴(yán)格而難以得到進(jìn)一步推廣，故在實(shí)驗(yàn)研究中，主要常用實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)法。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)法又包含特殊膳食誘導(dǎo)和化學(xué)藥物誘導(dǎo)兩種，特殊膳食主要以高能量飼料為主。Chalkley等[8]發(fā)現(xiàn)，用高能量膳食誘導(dǎo)健康動(dòng)物一定時(shí)間后可出現(xiàn)胰島素抵抗，但不能達(dá)到高血糖，即便能誘導(dǎo)出高血糖模型也需要比較長(zhǎng)的時(shí)間，大概半年到兩年不等。Maria等[9]用高脂肪食料飼養(yǎng)小鼠，1年后觀察到小鼠葡萄糖耐受試驗(yàn)明顯異常，且發(fā)現(xiàn)胰島素量代償性增加，可但空腹血糖變化不大?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)DGP模型的應(yīng)用較多的試劑有STZ和四氧嘧啶(ALX)，STZ、ALX均能有目的性的破壞哺乳動(dòng)物胰島β細(xì)胞。ALX價(jià)廉，造模過(guò)程中動(dòng)物的死亡率較高，注射后動(dòng)物對(duì)其有依懶性；而STZ雖價(jià)格比ALX稍高，但其誘導(dǎo)的模型較穩(wěn)定，死亡率低，故實(shí)驗(yàn)研究中用STZ較廣泛。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用STZ造模的主要有兩種方式，一種是單次大劑量注射STZ[10-12]，可使動(dòng)物血糖迅速升高，適合短時(shí)間內(nèi)需求高血糖動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)所用，此種造模方式復(fù)制的動(dòng)物模型更類似1型糖尿病，但單次大劑量注射STZ后會(huì)使動(dòng)物血糖過(guò)高，極易發(fā)生酮癥死亡，故此種方法造模的死亡率亦偏高，且動(dòng)物模型不穩(wěn)定；另一種方法是多次小劑量腹腔注射STZ溶液，可使血糖水平逐步上升，但此種方法是通過(guò)直接破壞胰島β細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，而與人類DGP發(fā)生過(guò)程差距較大。在復(fù)制糖尿病胃輕癱模型的研究中較多使用的有ALX聯(lián)合熟地灌胃以及小劑量STZ聯(lián)合高能量飲食喂養(yǎng)兩種。

本實(shí)驗(yàn)采用特殊膳食和化學(xué)藥物聯(lián)合誘導(dǎo)的造模方式，共分為兩期，第一期即特殊膳食誘導(dǎo)期，予大鼠高能量飼料喂養(yǎng)，4周后高能量喂養(yǎng)的模型組大鼠體重明顯增加，這一期大鼠的狀況接近人類糖尿病前期的脂代謝紊亂期；第二期為化學(xué)藥物誘導(dǎo)期，特殊膳食4周后，給大鼠小劑量鏈脲佐菌素溶液腹腔注射3次，逐漸破壞大鼠胰島β細(xì)胞。運(yùn)用化學(xué)藥物加速胰島β細(xì)胞的破壞，使其在病理機(jī)制上更接近于人類DGP發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)以空腹血糖和胃內(nèi)殘留率作為檢測(cè)造模成功的指標(biāo)，模型組大鼠空腹血糖明顯升高、胃內(nèi)殘留率升高，組織細(xì)胞圖片顯示胃竇平滑肌細(xì)胞的輕微改變，血清MLT、GAS水平升高，證實(shí)復(fù)制DGP模型成功，且造模過(guò)程中大鼠存活率達(dá)91.67%，表明本實(shí)驗(yàn)造模方法可獲得研究糖尿病DGP動(dòng)物模型。

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(2015-06-01收稿，2015-08-11修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華