楊 華，宋緒忠

（浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

馬銀花花粉萌發(fā)和貯藏特性

楊 華，宋緒忠

（浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

采用不同培養(yǎng)液、不同培養(yǎng)溫度不同貯藏時間和溫度、-80℃超低溫貯藏花粉不同解凍方法對馬銀花（Rhododendron ovatum）的花粉萌發(fā)特性及貯藏特性進行研究，結(jié)果表明：在25℃下，用100 g/L蔗糖＋100 mg/L硼酸＋100 mg/L GA3的離體培養(yǎng)液，培養(yǎng)4h花粉萌發(fā)率高，可達80%，GA3能促進花粉萌發(fā)和花粉管生長；各貯藏溫度下的花粉貯藏15 d萌發(fā)率都保持在高水平，但室溫貯藏花粉45 d失活，3.3℃貯藏花粉45 d萌發(fā)率可保持在36.11%，可作為生產(chǎn)應用的貯藏溫度；-80℃貯藏的花粉采用30℃水浴解凍2 min效果較好。

馬銀花；花粉；萌發(fā)；貯藏

杜鵑花是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑屬（Rhododendron）植物的總稱，是我國傳統(tǒng)十大名花之一，被世人譽為“花中西施”。馬銀花（Rhododendron ovatum）是一類常綠灌木，高達4 m，為杜鵑屬中的中國特有種。花色有淡紫色、紫色，花朵具有芳香性氣味，盛花期形成大片色塊，觀賞價值高。同時，馬銀花具有耐修剪，萌枝能力強、抗污染[1]的優(yōu)點，適宜園林地栽觀賞，值得開發(fā)應用。馬銀花的雜交育種常會遇到花期不遇的問題，特別是進行遠緣雜交時，這種問題就更為普遍，有時甚至需要使用貯藏1 a的花粉。本研究采用液體培養(yǎng)基，研究了蔗糖、硼酸、GA3等因素對馬銀花花粉萌發(fā)的影響，以期找出適宜花粉萌發(fā)及生活力測定的培養(yǎng)液配方，同時比較了不同培養(yǎng)溫度、貯藏方法對花粉生活力的影響，為有效開展馬銀花雜交育種研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苗木種植于浙江省林業(yè)科學研究院苗圃內(nèi)。2013年4月初馬銀花始花期，早上采集剛開放的花朵，此時花粉還未噴出，花粉量大、生活力好，帶回實驗室用于試驗。

1.2 試驗方法

先將花粉進行混合，取等量的花粉加入含有150 μL培養(yǎng)液的1.5 mL離心管中，用1 mL移液器吸取混勻的花粉培養(yǎng)液，滴3滴于單孔凹型載玻片孔內(nèi)，將載玻片放入保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)于人工氣候箱中光照培養(yǎng)。

使用BX51奧林巴斯顯微鏡，在20×10倍下觀察花粉粒，花粉管長度等于或超過花粉粒直徑、四合體只要有一個萌發(fā)的花粉管即視為已萌發(fā)，選擇3 ～ 5個視野拍照統(tǒng)計花粉的萌發(fā)情況。

花粉萌發(fā)率（%）= 萌發(fā)花粉粒數(shù)／花粉?？倲?shù)×100%

花粉管長度根據(jù)拍照時的比例進行測量。統(tǒng)計分析使用Excel2003及SPSS13.0軟件。

1.3 最佳培養(yǎng)液的確定

將蔗糖、硼酸、GA3設為3個因素，每個因素設3個水平，以花粉萌發(fā)率為評價指標，采用L9(34)正交表，進行正交試驗確定最佳培養(yǎng)液。因素水平見表 1。花粉置于25℃人工氣候箱中光照培養(yǎng)8.5 h，觀察花粉萌發(fā)情況。GA3為上海同瑞生物科技有限公司生產(chǎn)的75%結(jié)晶粉。蔗糖、硼酸為分析純。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels for orthogonal test

1.4 最適培養(yǎng)溫度的確定

在15、20、25、28℃ 4個溫度下，用4號培養(yǎng)液進行花粉培養(yǎng)，培養(yǎng)4 h后觀察花粉萌發(fā)情況。

1.5 最適貯藏時間和溫度的確定

將60朵花的混合花粉自然陰干1 d后，將花粉分裝于1.5 mL離心管中，用封口膠密封，分別放在室溫（22 ～ 30℃）、3.3、-22、-80℃的溫度環(huán)境下貯藏，在5、15、30、45、60、90、120 d觀察花粉的萌發(fā)情況，確定最佳貯藏時間和溫度?；ǚ凼褂?號培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。

1.6 超低溫貯藏花粉解凍方法

-80℃超低溫冰箱貯藏花粉5 d后，取出等量的花粉放入1.5 mL離心管中，進行26℃常溫下放置10 min、冰上放置10 min、30℃水浴2 min 3種處理，解凍后檢測花粉活力。

2 結(jié)果與分析

表2 正交試驗結(jié)果Table1 The results of orthogonal test

2.1 最佳培養(yǎng)液

利用正交試驗的方法，確定馬銀花花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)液。從表2可以看出，極差最大的是蔗糖，其次是GA3，最小的是硼酸。所以3個因素對萌發(fā)率影響的主次關系為蔗糖＞GA3＞硼酸。

從試驗結(jié)果來看，以第9號試驗為最好，萌發(fā)率達96.74%。經(jīng)極差分析后，蔗糖以3水平為好，硼酸以3水平為好，GA3 以2水平為好，與試驗結(jié)果一致。方差分析顯示，蔗糖對萌發(fā)率影響顯著（P＜0.05），而硼酸、GA3對萌發(fā)率影響不顯著。

在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，不同配方培養(yǎng)花粉管生長的情況有差異，為了適當縮短花粉培養(yǎng)時間，避免花粉培養(yǎng)液因長時間培養(yǎng)出現(xiàn)一定的蒸發(fā)，選出馬銀花花粉萌發(fā)率最高的4個培養(yǎng)液配方，即4、6、8、9號培養(yǎng)液，隨機選取30個萌發(fā)花粉，測量花粉管的長度。從分析結(jié)果可以看出，各培養(yǎng)液間花粉管生長差異極顯著，其中 4號培養(yǎng)液花粉管生長最長，是9號培養(yǎng)液的3.45倍，這說明利用4號培養(yǎng)液可以縮短培養(yǎng)時間，而且在配制培養(yǎng)液時還可以節(jié)省試劑。

表3 花粉管長度測量結(jié)果Table 3 The length of pollen tubes

表4 驗證試驗結(jié)果Table 4 The results of verification test

最后綜合考慮，選擇4號培養(yǎng)液進行馬銀花花粉培養(yǎng)，培養(yǎng)時間可縮短至4 h。

為驗證該培養(yǎng)液的合理性，進行3批驗證試驗，從表4結(jié)果可知，驗證試驗結(jié)果與正交試驗吻合。2.2 最適培養(yǎng)溫度

對不同溫度的4號培養(yǎng)液培養(yǎng)的花粉進行統(tǒng)計，在25℃下，花粉萌發(fā)率達93.55%，是15℃下花粉萌發(fā)率的135.6倍，比20℃和28℃下花粉萌發(fā)率高3.59倍及2.54倍。方差分析顯示，不同溫度處理間差異極顯著（P < 0.0000）。經(jīng)過LSD檢驗，除20℃和28℃花粉萌發(fā)率之間無顯著差異，其它各溫度條件下存在顯著差異（P < 0.05）。

表5 不同溫度培養(yǎng)花粉萌發(fā)率Table 5 The germination rate at different temperature

2.3 最適貯藏時間和溫度

將馬銀花貯藏在室溫（22 ～ 30℃）、3.3℃、-22℃、-80℃的溫度環(huán)境下，分別在 5、15、30、45、60、90、120 d時觀察花粉的萌發(fā)情況，以新鮮花粉80%的萌發(fā)率作為對照。結(jié)果顯示，除了-80℃條件下貯藏的花粉一直隨貯藏時間的延長萌發(fā)率下降，其它條件下花粉貯藏0 ～ 15 d時，花粉萌發(fā)率有明顯的先下降后上升再下降的現(xiàn)象，即為短期被迫休眠現(xiàn)象。

在室溫條件下，隨著季節(jié)的變化，自然氣溫不斷升高，在貯藏45 d時，即5月中旬，氣溫達到30℃左右，花粉幾乎全部失活，無法萌發(fā)。而貯藏在低溫和超低溫下的花粉此時萌發(fā)率都保持在30%以上，可以用于花期遲1個月左右的種間雜交。貯藏120 d時，貯藏在低溫和超低溫下的花粉萌發(fā)率保持在14.64% ～ 22.38%，其中以-80℃貯藏效果最差。

方差分析顯示，不同貯藏時間間、不同貯藏溫度間各花粉萌發(fā)率差異顯著（P＜0.00）。經(jīng)過 LSD檢驗，貯藏60、90、120 d間無顯著差異，貯藏45 d與貯藏60、90 d間無顯著差異，其它貯藏時間間存在顯著差異（P < 0.05）；室溫貯藏與3.3、-22、-80℃條件下貯藏存在顯著差異（P < 0.05），而3.3、-22、-80℃ 3種貯藏條件下的花粉萌發(fā)率沒有顯著差異。

表6 不同解凍方法的花粉萌發(fā)率Table 6 The germination rate of pollen treated with different thawing methods

2.4 最佳超低溫貯藏花粉解凍方法

不同解凍方法對花粉生活力有影響，30℃水浴2 min 與25℃放置10 min兩種方法花粉的萌發(fā)率間存在顯著差異（P < 0.05），以30℃水浴2 min的解凍效果較好，是25℃放置10 min方法的1.96倍。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同培養(yǎng)液對花粉萌發(fā)的影響

蔗糖是花粉萌發(fā)的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源，不同植物種類甚至品種其花粉離體培養(yǎng)對蔗糖濃度要求不同[2]。這可能是由于不同植物、品種的花粉細胞中內(nèi)含物含量不同，要求適宜的細胞壁內(nèi)外滲透壓才能生長。胞內(nèi)滲透壓低于胞外易造成胞內(nèi)水份外滲，高于胞外則造成細胞過分膨脹，都不利于花粉細胞生長。本研究結(jié)果也表明，蔗糖是影響馬銀花花粉萌發(fā)的主要因子[3]，100 ～ 200 g/L的蔗糖濃度都促進馬銀花花粉萌發(fā)。

適量硼也是花粉萌發(fā)和生長所必需，它能促進糖的吸收與代謝，并促進花粉管的伸長生長，在缺硼的情況下會引起土豆花粉敗育[4]。本研究認為100 ～ 200 mg/L的硼酸濃度能適合馬銀花花粉萌發(fā)。

關于赤霉素對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響雖然有一些報道，但是較多的研究結(jié)果認為50 mg/L以下的低濃度赤霉素對花粉萌發(fā)和花粉管生長有明顯的促進作用[5]。本研究結(jié)果認為50 ～ 100 mg/L的GA3促進馬銀花花粉萌發(fā)，200 mg/L的GA3才有抑制作用，馬銀花花粉相對其他種類能適應更高濃度的GA3濃度，這與盧精林和趙建雄[6]、劉雪蓮[7]等的研究結(jié)果較為相似。本研究采用張超儀和耿興敏[8]提出的馬銀花最佳離體培養(yǎng)液配方50 g/L蔗糖＋200 mg/L硼酸，對所采的馬銀花花粉進行培養(yǎng)，經(jīng)過24 h仍未見有花粉萌發(fā)。但采用本研究的離體培養(yǎng)液4號配方100 g/L蔗糖＋100 mg/L硼酸＋100 mg/L GA3，經(jīng)過4 h即可獲得80%以上的萌發(fā)率，不僅效率高而且效果好。從這進一步說明，一定量的GA3濃度可促進馬銀花花粉萌發(fā)。在雜交育種時，花粉能否在柱頭上正常萌發(fā)和花粉管能否正常生長到達胚珠完成受精至關重要，對于遠緣雜交來說，克服遠緣雜交不親和及雜種不育性更是如此。張雪梅等[9]在研究蘋果授粉時發(fā)現(xiàn)，自花授粉后24 h自交親和品種花柱GA3最高，自交不親和品種花柱GA3含量則無明顯變化，而且自交不親和品種花粉管已停止生長。本研究的液體培養(yǎng)基有利于促進馬銀花花粉的萌發(fā)及花粉管的快速生長，在進行雜交試驗時，在柱頭上使用此培養(yǎng)液，可能會縮短受精時間，提高坐果率和促進果實發(fā)育，實現(xiàn)雜交成功的目的。

3.2 不同培養(yǎng)溫度對花粉萌發(fā)的影響

對不同溫度培養(yǎng)的花粉進行統(tǒng)計，25℃下馬銀花花粉萌發(fā)率高達93.55%，比最低的15℃下萌發(fā)率高135.6倍。20℃和28℃花粉萌發(fā)率差異不顯著。當然，在低溫下，部分花粉萌發(fā)慢，萌發(fā)所需要的時間可能會延長，造成在本研究的培養(yǎng)時間內(nèi)未觀察到。由此可推測，溫度對馬銀花花粉萌發(fā)的影響較大，在野外進行授粉，氣溫對授粉的成功也會造成影響。

3.3 不同的貯藏條件對花粉萌發(fā)的影響

馬銀花花粉貯藏過程中，除了-80℃條件下貯藏的花粉一直隨貯藏時間的延長萌發(fā)率降低，其它條件下花粉貯藏0 ～ 15 d時，花粉萌發(fā)率有明顯的先下降后上升再下降的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象在梨[10]、棗[11]中有報道，稱為短期被迫休眠現(xiàn)象，引起的具體原因有待進一步研究。在室溫條件下馬銀花花粉貯藏45 d幾乎全部失活，無法萌發(fā)，而貯藏在低溫和超低溫下的花粉萌發(fā)率都保持在30%以上，可以用于花期遲1個月左右的種間雜交。方差分析顯示，3.3、-22、-80℃ 3種貯藏條件下的花粉萌發(fā)率無差異，說明在一定低溫條件下，貯藏溫度對馬銀花花粉貯藏影響不大。從節(jié)約生產(chǎn)成本、方便可行來看，3.3℃可作為生產(chǎn)應用的貯藏溫度。在較多的研究中認為，貯藏溫度越低，貯藏效果越好[12]，但不同物種或品種的花粉適宜貯藏溫度不同。歐陽英等[13]對密花石斛花粉的貯藏研究結(jié)果說明，4℃保存效果比-20℃保存效果好，但比-196℃液氮保存效果差。喬紅蓮等[14]研究認為百合品種‘Brunello’花粉適合4℃冷藏，呂晉慧等[15]認為雜交育種中可選擇4℃貯藏地被菊花粉。在超低溫貯藏花粉時，最好先經(jīng)過解凍再進行培養(yǎng)。本研究結(jié)果認為30℃水浴2 min的解凍效果較好。但是在貯藏花粉120 d時，-80℃的貯藏條件并不是最好的，這也許與花粉解凍過程部分死亡有關。

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Characteristics of Pollen Germination and Storage of Rhododendron ovatum

YANG Hua，SONG Xu-zhong
（Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China）

∶Experiments were conducted on characteristics of pollen germination and storage of Rhododendron ovatum with different culture solution and temperature, storage duration and temperature, thawing methods after storage under -80℃. The results showed that pollen germination rate topped to 80% with culture medium of 100 g/L sucrose+100 mg/L boric acid +100 mg/L GA3 at 25℃ for 4 hours. The experiments indicated that pollen germination rate and growth of pollen tubes were promoted significantly by GA3. The germination rate kept high 15 days later under each tested storage temperature. The pollen was inactivation 45 days after storage at room temperature. But the pollen germination rate kept 36.11% after storage at 3.3℃ for 45 days. Pollen(stored at -80℃) thawed with 30℃ aqueous bath for 2 minutes had better effect of germination rate.

∶Rhododendron ovatum; pollen; germination; storage

S685.21

A

1001-3776（2015）01-0049-05

2014-04-02；

2014-07-15

浙江省省院合作林業(yè)科技項目（2012SY02-1）

楊華（1976-），女，江蘇揚州人，副研究員，博士，從事植物遺傳育種研究。