洛伐他汀對心肌細胞轉化生長因子β1和白細胞介素-6的調節(jié)

郭威早楊漫杜愛華張婭喃孟令杰徐娟劉會臣

(航天中心醫(yī)院臨床藥理室，北京100049)

摘要〔〕目的研究洛伐他汀對心肌細胞中轉化生長因子(TGF)-β1和白細胞介素(IL)-6表達水平的影響。方法大鼠心肌細胞株H9c2(2-1)進行體外培養(yǎng)過程中，以100 nmol/L洛伐他汀處理72 h，采用蛋白免疫印跡雜交檢測TGF-β1和IL-6蛋白表達水平，然后進行量化比較分析。結果洛伐他汀處理導致心肌細胞TGF-β1和IL-6蛋白表達水平分別下降到對照水平的(69.70±20.89)%和(56.26±25.04)%，兩組內處理組和對照組的差異均具有統計學意義(TGF-β1組:P=0.013;IL-6組:P=0.008)。結論洛伐他汀在心肌細胞中抑制TGF-β1和IL-6的表達，該效應可能是洛伐他汀抗炎機制的關鍵因素之一。

關鍵詞〔〕洛伐他?。晦D化生長因子β1；白細胞介素-6；心??；炎癥

中圖分類號〔〕R541.4〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：航天科工集團基金(2011JKBZ006)

The regulation of lovastatin on transforming growth factor β1 and interleukin-6 in cardiac myocytes

GUO Wei-Zao,YANG Man,DU Ai-Hua,etal.

Department of Clinical Pharmacology,Aerospace Center Hospital,Beijing 100049,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the regulation of lovastatin on transforming growth factor(TGF)-β1 and interleukin(IL)-6 in cardiac myocytes.MethodsRat myocardium H9c2(2-1) cells in culture were treated with 100 nmol/L lovastatin for 72 h. The protein levels of TGF-β1 and IL-6 were detected through immunoblotting and then quantitatively comparing. ResultsAfter treatment with lovastatin,the average protein levels of myocardial cellular TGF-β1 and IL-6 were decreased to(69.70±20.89)% and(56.26±25.04)% respectively with statistical significances for both TGF-β1(P=0.013) and IL-6(P=0.008). ConclusionsLovastatin inhibits protein levels of both TGF-β1 and IL-6 in cardiac myocytes,which might constitute a key factor in the anti-inflammation mechanisms of lovastatin.

【Key words】Lovastatin;Transforming growth factor β1;Interleukin-6;Myocardium;Inflammation

第一作者：郭威早(1967-),女,碩士，副主任醫(yī)師，主要從事臨床藥理及心血管內科疾病研究。

炎癥反應在心血管疾病如冠心病發(fā)病中的重要作用〔1〕。在某種意義上，一些心血管疾病如動脈粥樣硬化的本質就是復雜性炎性疾病〔2〕。近年來，炎癥分子生物學的一個重要進展就是對轉化生長因子(TGF)-β在炎癥調節(jié)中作用的認識，例如對T淋巴細胞功能的影響和多種白細胞相互作用等〔3〕。但該細胞因子在心血管疾病中的作用，特別是炎癥調控作用基本上處于未明狀態(tài)。炎癥反應的另一個重要分子白細胞介素(IL)-6與心血管的關系很早就受到關注，其中一個重要原因就是與C-反應蛋白(CRP)之間的關系〔4〕。洛伐他汀是代表性降脂藥，我們既往的研究對其抗炎作用進行了探索〔5〕，本研究檢測了洛伐他汀對TGF-β1及IL-6的調節(jié)作用，基于此探索了心血管病治療中抗炎的分子機制。

1材料與方法

1.1心肌細胞培養(yǎng)和藥物處理大鼠心肌細胞H9c2(2-1)由ATCC公司購得。細胞培養(yǎng)采用本課題組針對該細胞株建立的培養(yǎng)方法：采用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清，在5% CO2,37℃條件下培養(yǎng)。一輪培養(yǎng)3 d，然后按1∶4的比例分盤繼續(xù)培養(yǎng)，細胞脫壁收集采用0.25%(重量/體積)胰蛋白酶合并0.53 mmol/L EDTA溶液處理10 min。洛伐他汀(Sigma-Aldrich公司)用二甲基亞砜稀釋至100 μmol/L作為原液，在細胞貼壁達到培養(yǎng)皿底面積約75%時，加入洛伐他汀至細胞培養(yǎng)液，使終濃度達到100 nmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2蛋白免疫印跡雜交心肌細胞通過1 000 r/min，10 min離心收集后，重懸于1.0 ml冰冷裂解緩沖液，再轉移至2.0 ml Eppendorf管中。裂解緩沖液包括：20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA,2.5 mmol/L焦磷酸鈉,1% Triton X-100,150 mmol/L氯化鈉,1 mmol/L β-磷酸甘油。臨使用前加入5 mmol/L二硫蘇糖醇，1%磷酸酶抑制劑Cocktail Ⅰ,1%磷酸酶抑制劑Cocktail Ⅱ,10%磷酸酶抑制劑Cocktail(磷酸酶抑制劑購自Sigma-Aldrich公司)。樣本通過Virtis超聲細胞粉碎儀進行超聲剪切(設置2.0,處理1 s×10次)，然后，樣本在14 000 r/min離心5 min去除不溶性沉渣。蛋白濃度測定采用Pierce公司BCA蛋白試劑盒進行。等量的蛋白加入到SDS-PAGE進行電泳分離然后電轉移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜上的非特異結合通過以下雜交液屏蔽。雜交液包括Tris緩沖鹽水，0.1%吐溫-20，5%脫脂牛奶。TGF-β和IL-6抗體(Santa Cruz生物技術公司)根據產品說明書稀釋并根據初始測試調整，正式實驗中采用1∶200的比例稀釋。次級抗體為辣根過氧化物酶耦聯的抗兔抗體。β-肌動蛋白抗體(Cell Signaling 公司)用作上樣對照。免疫復合物用ECL加強型試劑盒(Amersham/GE公司)探測。免疫印跡的定量分析采用Syngene G:BOX凝膠建檔及分析系統(Syngene公司)進行。

1.3統計學分析計量資料行雙側配對t檢驗。

2結果

2.1洛伐他汀處理降低心肌細胞TGF-β1水平體外培養(yǎng)的大鼠H9c2(2-1)心肌細胞經洛伐他汀72 h處理后，與對照相比無顯著形態(tài)學改變。洛伐他汀處理后，TGF-β1蛋白水平(110.23±33.03)%降低至對照組水平(158.14±38.65)%的(69.70±20.89)%，變化率-30.30%，改變具有顯著的統計學意義(P=0.013)。

2.2洛伐他汀處理降低心肌細胞IL-6水平與TGF-β1水平的改變類似，體外培養(yǎng)的大鼠H9c2(2-1)心肌細胞經洛伐他汀72 h處理后，IL-6蛋白水平(69.59±30.98)%降低至對照組水平(123.70±47.67)%的(56.26±25.04)%，變化率-43.70%，差異具有統計學意義(P=0.008)。

圖1　洛伐他汀處理后心肌細胞 TGF-β1和IL-6蛋白水平的變化

3討論

洛伐他汀作為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是降脂藥的代表，其降脂作用被長期的臨床實踐所證實。近來的研究注意到此類調脂藥物的其他藥理效應，其中在心血管方面最值得關注的就是其抗炎作用。本研究在課題組既往研究的基礎上〔5,6〕進行了進一步的擴展。研究發(fā)現，在心肌細胞中，洛伐他汀對TGF-β1和IL-6均具有抑制效應。

TGF-β是近期受到高度關注的免疫調節(jié)分子靶點。該細胞因子至少具有3個亞型，即TGF-β1～3，其中以TGF-β1研究得最為廣泛和深入，故本研究選取TGF-β1為研究對象。TGF-β1調節(jié)細胞生長、分化和凋亡等，與眾多疾病，特別是伴隨各種免疫失調的疾病相關，其中包括心血管病。TGF-β1在疾病中的作用非常復雜，甚至相互矛盾，誘發(fā)或抑制均有可能〔7,8〕，因此吸引了大量的研究者關注。

IL-6 一個重要的結構特征是螺旋細胞因子結構，其他一些具有同樣結構的細胞因子因此歸入IL-6家族，其中包括心臟營養(yǎng)因子(cardiotropin)-1，由此也可見IL-6及其家族分子在心血管疾病中舉足輕重的作用。與TGF-β1在疾病中表現的復雜性一樣，IL-6在疾病中的作用也十分復雜，具有多面性〔9〕。

洛伐他汀在心肌細胞水平上抑制TGF-β1和IL-6，有可能作為其抗炎機制的基礎之一，但鑒于本研究涉及的2個細胞因子具有復雜性作用機制，對本研究結果的結論性解讀尚需進一步的實驗研究和臨床觀察。

4參考文獻

1Libby P,Tabas I,Fredman G,etal.Inflammation and its resolution as determinants of acute coronary syndromes〔J〕.Circ Res,2014;114(12):1867-79.

2Duchatelle V,Kritikou EA,Tardif JC.Clinical value of drugs targeting inflammation for the management of coronary artery disease〔J〕.Can J Cardiol,2012;28(6):678-86.

3Yoshimura A,Wakabayashi Y,Mori T.Cellular and molecular basis for the regulation of inflammation by TGF-beta〔J〕.J Biochem,2010;147(6):781-92.

4Bastard JP,Jardel C,Delattre J,etal.Evidence for a link between adipose tissue interleukin-6 content and serum C-reactive protein concentrations in obese subjects〔J〕.Circulation,1999;99(16):2221-2.

5Guo W,Liu H,Li L,etal.Regulation of lovastatin on a key inflammation-related microRNA in myocardial cells〔J〕.Chin Med J(Engl),2014;127(16):2977-81.

6Guo WZ,Ji H,Yan ZH,etal.Lovastatin changes activities of lactate dehydrogenase A and B genes in rat myocardial cells〔J〕.Chin Med J(Engl),2011;124(3):423-8.

7Clancy RM,Buyon JP.Clearance of apoptotic cells:TGF-beta in the balance between inflammation and fibrosis〔J〕.J Leukoc Biol,2003;74(6):959-60.

8Wahl SM.Transforming growth factor beta(TGF-beta)in inflammation:a cause and a cure〔J〕.J Clin Immunol,1992;12(2):61-74.

9Mathew S,Bartels J,Banerjee I,etal.Global sensitivity analysis of a mathematical model of acute inflammation identifies nonlinear dependence of cumulative tissue damage on host interleukin-6 responses〔J〕.J Theor Biol,2014;358:132-48.

〔2014-12-21修回〕

(編輯徐杰)