胃癌組織中TGFβ1，Smad3，Smad7與ki-67 mRNA表達(dá)及其相關(guān)性

張德利馬艷周姝1

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，河北承德067000)

摘要〔〕目的探討轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA在胃癌中的表達(dá)及其相關(guān)性。方法選擇經(jīng)病理證實(shí)為胃癌組織的標(biāo)本60例，正常胃組織標(biāo)本20例，采用RT-PCR技術(shù)檢測TGFβ1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA與ki-67 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果在胃癌組織中，TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA水平明顯高于正常胃組織(P<0.05)，Smad3 mRNA水平明顯低于正常胃組織(P<0.05)。低分化胃癌組織中TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA水平明顯高于高中分化胃癌組織(P<0.05)，Smad3 mRNA水平明顯低于高中分化胃癌組織(P<0.05)。TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA三者在胃癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，Smad3 mRNA與TGFβ1、Smad7、ki-67 mRNA呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論正常胃組織和胃癌組織中TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA的表達(dá)有差異，其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及分化程度密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕胃癌；TGFβ1；Smad3；Smad7；ki-67

中圖分類號〔〕R735.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項(xiàng)目(20132036)

通訊作者：周姝(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃癌的基礎(chǔ)與臨床研究。

1吉林省腫瘤醫(yī)院麻醉科

第一作者：張德利(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃癌的基礎(chǔ)與臨床研究。

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β/Smads信號通路中的任意環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都可能導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，從而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生與發(fā)展〔1,2〕，Smad3和Smad7是TGFβ/Smads信號傳導(dǎo)通路中的組件。在基礎(chǔ)狀態(tài)下Smad7大部分位于細(xì)胞核中，而ki-67僅在增殖細(xì)胞核中表達(dá)，是較為理想的檢測細(xì)胞增殖活性的抗體。目前關(guān)于TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA在胃癌中的研究尚未見報道，本研究擬通過在基因水平研究其相互關(guān)系，為研究胃癌的發(fā)病機(jī)制及藥物治療的潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1研究對象收集我院2011年12月至2012年9月手術(shù)治療后經(jīng)病理證實(shí)的胃癌組織標(biāo)本60例和正常胃組織20例(距離腫瘤10 cm以上認(rèn)為是正常胃組織)。60例胃癌患者中，男38例，女22例，年齡43～77歲，平均(54.8±9.7)歲；低分化者32例，高中分化者28例。

1.2RT-PCR所用試劑AMV第一鏈cDNA合成試劑盒(SK1040)(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，引物合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，50 bp DNA Ladder(北京天根生化有限公司MD108)，相關(guān)引物序列，TGFβ1正義：5′-GGCCAGATCCTGTCCAAGC-3′，反義：5′-GTGGGTTTCCACCATTAGCAC-3′；Smad3正義：5′-CCATCTCCTACTACGAGCTGAA-3′，反義:5′-CACTGCTGCATTCCTGTTGAC-3′；Smad7正義:5′-TTCCTCCGCTGAAACAGGG-3′，反義:5′-CCTCCCAGTATGCCACCAC-3′；ki-67正義:5′-ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG-3′，反義:5′-CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA-3′；β-actin正義:5'-CATGTACGT TGCTATCCAGGC-3′；反義:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.3方法

大部分Smad7在基礎(chǔ)狀態(tài)下位于細(xì)胞核中，接受TGF-β刺激后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，通過與Smad3競爭TGF-βRI而阻斷TGF-β的信號傳導(dǎo)，形成所謂的自分泌反饋抑制通路，調(diào)節(jié)正性和負(fù)性Smads。本實(shí)驗(yàn)證明Smad3的表達(dá)缺失，TGFβ1、Smad7蛋白的異常表達(dá)共同參與了胃癌的發(fā)生。

1.3.2瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析采用Image pro plus 7.0軟件統(tǒng)計各條帶的積分光密度值。

2.2TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA的相關(guān)性分析TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA在胃癌中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.51,0.67,均P<0.01)，Smad3 mRNA與TGFβ1、Smad7、ki-67 mRNA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.47,-0.42,-0.39,P<0.01)。

2結(jié)果

8Fitchev PP，Weislak SM，Lee C，etal.Thrombospondin-1 regulates the normal prostate in vivo through angiogenesis and TGF-beta activation〔J〕.Lab Invest，2010；90(7)：1078-90.

辜鴻銘先生在評價民國時的英語教育時曾說過“今人讀英文十年，開目僅能閱報，伸紙僅能修函，皆由幼年讀一貓一狗式之教科書，是以終其身只有小成?！惫P者在大學(xué)從事公共英語教學(xué)已有21年時間，回顧這21年的教學(xué)歷程，筆者不得不感嘆：在辜先生眼中的“小成”儼然是當(dāng)今大部分大學(xué)生難以達(dá)到的“巔峰”。別說是“閱報”“修函”，僅一篇英文自我介紹就讓許多人撓頭不已。英語學(xué)習(xí)經(jīng)歷是相當(dāng)一部分國人學(xué)習(xí)生涯之“痛”。

TGFβ1調(diào)控的基因通常依賴于TGFβ1活化的Smad2或Smad3，Smad3的激活主要發(fā)生在活化的細(xì)胞。大多數(shù)調(diào)控TGFβ轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)由Smad3、Smad4介導(dǎo)。Smad3通過結(jié)合靶基因啟動子區(qū)的Smad3/Smad4 DNA結(jié)合序列，直接啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。TGFβ介導(dǎo)的生長抑制由Smad3介導(dǎo)，Smad3調(diào)節(jié)c-myc，p21Cipl的表達(dá)及Rb磷酸化狀態(tài)〔5〕。Han等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，缺乏Smad3的胃癌細(xì)胞不受TGF-β的生長抑制作用，當(dāng)重新導(dǎo)入Smad3后又表現(xiàn)出生長抑制。亦有研究發(fā)現(xiàn)Smad3基因敲除的小鼠具有抵抗化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)皮膚癌形成的功能〔7〕。研究結(jié)果顯示，Smad7也可通過抑制Smad3的活化、Smad3/Smad4異源復(fù)合物的形成及核轉(zhuǎn)位，拮抗TGFβ對細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中TGF-β1與Smad7的表達(dá)是互相調(diào)節(jié)，共同發(fā)揮作用的。有研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，TGF-β作用較長時間(2 d)后，可直接導(dǎo)致興奮性信號分子Smad3的基因表達(dá)水平下降，抑制性信號分子Smad7的基因表達(dá)水平顯著上升，而使胞內(nèi)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能下調(diào)，細(xì)胞對TGF-β的反應(yīng)減弱。此外，在體外正常皮膚成纖維細(xì)胞中，TGF-β可使Smad7的表達(dá)快速而短暫地被誘導(dǎo)，這就提示Smad7是TGF-β早期即刻基因作用的靶點(diǎn)，起到了自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用。同時，這說明TGF-β不僅可刺激Smads信號通路功能的活化，其對內(nèi)源性Smads的表達(dá)也起到了潛在的調(diào)節(jié)作用。近來的報道顯示，Smad7基因的擴(kuò)增與胃癌，結(jié)腸癌患者的預(yù)后不良有著密切的關(guān)系。表明TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子Smad7過表達(dá)是腫瘤細(xì)胞抵抗TGF-β的生長抑制作用的機(jī)制之一〔9，10〕。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和直線相關(guān)分析。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大于4mg/ml濃度的槐耳清膏作用 NCI-N87 24h 后，Beclin-1、LC3-II、PTEN在mRNA水平及蛋白水平均明顯升高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義，且與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性。從上述結(jié)果我們推測，槐耳清膏可能影響自噬基因Beclin-1表達(dá)，同時增加PTEN表達(dá)，導(dǎo)致自噬發(fā)生，較高濃度的槐耳清膏效果明顯，但超過32mg/ml是否自噬效應(yīng)增加尚沒有試驗(yàn)結(jié)果證明。

臨床病理特征TGFβ1/β-actinSmad3/β-actinSmad7/β-actinki-67/β-actin正常胃組織0.21±0.020.59±0.070.08±0.010.12±0.01高中分化胃癌組織0.57±0.061)2)0.33±0.031)0.17±0.021)0.53±0.061)低分化胃癌組織0.89±0.091)2)0.09±0.011)2)0.42±0.051)2)0.82±0.101)2)

與正常胃組織比較:1)P<0.01;與高中分化胃癌組織比較:2)P<0.01

M.100 bp DNA Marker；1.正常胃組織 2.高中分化胃癌組織；3.低分化胃癌組織 圖1　TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67在各組織中的表達(dá)

3討論

Smad蛋白家族是TGFβ信號傳遞途徑中的中轉(zhuǎn)分子〔3〕。Smad3、Smad7均為Smads家族的主要成員，是TGFβ信號傳導(dǎo)途徑中必需的下游分子，其性質(zhì)的改變可與多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)。Smad3作為腫瘤抑制基因在TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用；Smad7的異常表達(dá)可以拮抗TGFβ通路，從而使其不能有效監(jiān)督腫瘤細(xì)胞的過度增生，從而引發(fā)腫瘤〔4〕。

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1.3.1實(shí)驗(yàn)方法提取RNA按說明書嚴(yán)格進(jìn)行，采用Trizol提取總RNA，目的基因與內(nèi)參的PCR反應(yīng)條件均為94℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)32次，取20 μl擴(kuò)增產(chǎn)物及6 μl的DNA Ladder過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝片。

TGFβ1在許多細(xì)胞中具有廣泛的作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胃癌組織中TGFβ1的表達(dá)與ki-67有正相關(guān)性。隨著胃癌臨床分期的進(jìn)展，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，TGFβ1和ki-67的表達(dá)均增強(qiáng)，說明TGFβ1的表達(dá)越強(qiáng)，胃癌細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。最近的研究顯示，Smad7可以不依賴TGF-β而獨(dú)立發(fā)揮其生物學(xué)功能〔11，12〕，因此本研究結(jié)論的有關(guān)機(jī)制還需要更加深入的探討。

4參考文獻(xiàn)

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7Li AG，Lu SL，Zhang MX，etal.Smad3 knockout mice exhibit a resistance to skin chemical carcinogenesis〔J〕.Cancer Res，2004；64(21)：7836-45.

2.1RT-PCR檢測結(jié)果在胃癌組織中，TGFβ1、Smad7與ki-67 mRNA的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)，Smad3 mRNA的表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)。TGFβ1、Smad3、Smad7與ki-67 mRNA的表達(dá)與胃癌的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。見表1、圖1。

6Han SU，Kim HT，Seong Do，etal.Loss of Smad3 expression increases susceptibility to tumorigenicity in human gastric cancer〔J〕.Oncogene，2004；23：1333-41.

結(jié)果表明，試件壁厚從4 mm到12 mm的極限承載力顯著提高，分別為157 kN、163 kN、167 kN和183 kN，當(dāng)壁厚大于8 mm時，柱子極限承載力提高幅度開始增大；而小于8 mm時，承載力提高幅度基本不大。加大鋼管厚度，承載力逐漸提高但提高幅度有限。壁厚4 mm、6 mm的極限承載力比壁厚8 mm、10 mm、12 mm的極限承載力更早達(dá)到。

科學(xué)評審小組負(fù)責(zé)對報送美國國立衛(wèi)生研究院的大部分（約75%）課題申請書進(jìn)行初審。其根據(jù)學(xué)科和研究領(lǐng)域建立的100多個科學(xué)評審小組是該評審系統(tǒng)的核心，各科學(xué)評審小組主要由各研究領(lǐng)域或醫(yī)學(xué)專業(yè)著名的非政府科學(xué)家組成，成員一般有16～20人，名單一般在網(wǎng)絡(luò)公開，由相應(yīng)的科學(xué)評審管理官員（Scientific Review Administrator，SRA）負(fù)責(zé)管理。初審分網(wǎng)評和會評兩步。

4)在機(jī)車C4、C5修程時對主斷路器的各插座及聯(lián)鎖觸頭系統(tǒng)各部件表面清潔，不許有裂損、變形；更新主斷路器7-8，9-10，11-12輔助聯(lián)鎖。

10Jiang X，Castelao JE，Vandenberg D，etal.Genetic variations in SMAD7 are associated with colorectal cancer risk in the colon cancer family registry〔J〕.PLoS One，2013；8(4)；604-14.

40年來，全省自然資源系統(tǒng)廣大干部職工堅決貫徹黨的理論和路線方針政策，按照省委、省政府部署要求，牢記職責(zé)使命，勇立時代潮頭，圍繞中心、服務(wù)大局，拼搏進(jìn)取、砥礪前行，取得了一個又一個輝煌成就，譜寫了自然資源事業(yè)改革發(fā)展的壯麗篇章。

11Hong S，Lee C，Kim SJ.Smad7 sensitizes tumor necrosis factor induced apoptosis through the inhibition of antiapoptotic gene expression by suppressing activation of the nuclear factor-kapp-aB pathway〔J〕.Cancer Res，2007；21(67)：9577-631.

12Kimura ET，Matsuo SE，Ricarte-Filho JC.TGF beta，activin and SMAD signalling in thyroid cancer〔J〕.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007；14(51)：683-9.

〔2015-03-17修回〕

(編輯滕欣航)