溫陽抗寒合劑改善小鼠支氣管哮喘的作用及機制

李昕輝

(北華大學附屬醫(yī)院呼吸科，吉林吉林132011)

摘要〔〕目的觀察溫陽抗寒合劑(WYKHM) 對哮喘小鼠的治療作用及機制。 方法90只Balb/c小鼠隨機分為空白對照組、哮喘組、氨茶堿組、WYKHM高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低劑量組(50 mg/kg)。卵蛋白(OVA)致敏小鼠，7 d后給藥，14 d后OVA攻擊引發(fā)哮喘，48 h后測定外周血中白細胞分類計數(shù)、白介素(IL)-5和IL-23水平，一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。結果WYKHM能顯著降低外周血中NO和NOS的含量，與哮喘組比較差異極其顯著(P<0.05或P<0.001)；治療組和氨茶堿組外周血中IL-5和IL-23水平也明顯低于哮喘組(P<0.01或P<0.001)；WYKHM治療后，外周血中SOD水平明顯上升，MDA水平明顯下降，與對照組和哮喘組比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)。結論WYKHM通過降低NOS活性和NO水平，降低IL-5和IL-23水平，提高SOD活性，降低MDA水平改善哮喘。

關鍵詞〔〕溫陽抗寒合劑；支氣管哮喘；白介素-5；白介素-23

中圖分類號〔〕R562.25〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：吉林市科技局科技發(fā)展計劃項目資助課題(No.200903010)

第一作者：李昕輝(1966-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事變態(tài)反應性疾病的研究。

哮喘的病理特征為支氣管黏膜的嗜酸性粒細胞(EOS)，淋巴細胞等炎癥細胞浸潤。相關細胞因子如白細胞介素(IL)-5參與對效應細胞的分化、黏附、遷移與功能激活〔1,2〕。IL-23與抗腫瘤免疫、抗感染免疫及自身免疫病密切相關，在過敏原刺激下分泌產(chǎn)生大量的IL-23參與哮喘發(fā)病〔3〕。溫陽抗寒合劑(WYKHM)是根據(jù)張仲景配方并在之基礎上，根據(jù)哮喘特點增加了具有溫熱、抗炎、止咳、平喘的成分，該藥配方科學，藥理作用獨特，經(jīng)內外調節(jié)和陰陽平衡將呼吸系統(tǒng)與機體功能協(xié)調起來，有標本兼治的功效。本實驗通過觀察WYKHM對哮喘小鼠血清中一氧化碳(NO)、NO合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和IL-5、IL-23相關細胞因子的影響，為揭示哮喘發(fā)病機制和中藥新藥研發(fā)奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑Balb/c小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，由吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物部提供，合格證號：醫(yī)動字第10-5107。WYKHM由四川中醫(yī)藥研究所提供。IL-5 和IL-23 ELISA檢測試劑盒(96份)：深圳晶美公司；1%和10%卵白蛋白(OVA)：北京經(jīng)科公司；10%氫氧化鋁凝膠：本教研室自行配制；NO檢測試劑盒，NOS檢測試劑盒，SOD檢測試劑盒，MDA檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。超聲霧化器：溫州奧迪科技公司；霧化吸入箱：自制；電子顯微鏡：JEM-100SX，日本電子公司；全自動酶標儀：美國 Bio-RAD；96孔酶標板：南京建成；恒溫超速離心機：上海分析儀器廠。

1.2哮喘小鼠模型的建立及給藥小鼠腹腔注射10%OVA、10%氫氧化鋁凝膠致敏，2 w后以1%OVA溶液超聲霧化，通入霧化吸入箱5 min，放入小鼠繼續(xù)霧化20 min激發(fā)，連續(xù)激發(fā)3 d。觀察小鼠反應，若有煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、兩便失禁等為陽性。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水0.1 ml，14 d后用37℃生理鹽水霧化吸入，共3 d，1次/d，20 min/次。小鼠致敏后1 w，各組開始灌胃給藥，氨茶堿組(20 mg/kg)、高劑量組(200 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)、低劑量組(50 mg/kg)，連續(xù)1 w，同時觀察動物反應。

1.3血漿中細胞分離計數(shù)及各項指標的測定最后一次給藥后24 h，小鼠眶靜脈取血置入含肝素的試管中，同時取血涂片測定細胞總數(shù)、白細胞分類計數(shù)(WBC)。檢測血漿中細胞因子IL-5和IL-23、NO、MDA水平、NOS、SOD活性。

1.4IL-5、IL-23的測定本實驗采用雙抗體夾心法測定血漿中IL-5和IL-23濃度，酶標板中包被有抗IL-5和IL-23抗體，稀釋液后加入等量的標準液、對照液及樣品，反應后2 h用緩沖液吸出并沖洗每孔，重復5次，標本中未與抗IL-5抗體和IL-23抗體結合的部分被洗掉，最后加入IL-5和IL-23連接液孵育2 h，再次沖洗，加入底物及反應終止液，在波長450 nm處測定光密度值OD，根據(jù)標準曲線計算出血漿中IL-5和IL-23含量。

1.5統(tǒng)計學方法應用SPSS11.0軟件方差分析、t檢驗和直線相關分析。

2結果

2.1外周血中WBC和細胞分類百分比與對照組比較，哮喘組WBC計數(shù)和EOS分類百分比明顯增多；與哮喘組比較，WYKHM高劑量組能明顯降低EOS分類百分比(P<0.01)；與對照組比較，中、低劑量組能增加WBC總數(shù)和EOS分類百分比(P<0.01)。見表1。

2.2外周血中IL-5和IL-23水平變化與對照組相比，哮喘組外周血中IL-5、IL-23含量顯著升高(P<0.01或P<0.001)，氨茶堿組血中IL-23水平升高(P<0.01)；與哮喘組相比，WYKHM高、中、低劑量組均能降低IL-5水平及IL-23水平(P<0.01或P<0.001)。見表2。

2.3外周血中EOS計數(shù)與IL-5水平的相關性將外周血中IL-5水平與血中EOS數(shù)量做直線相關分析，結果顯示二者呈顯著正相關(γ=0.878，P<0.05)。

2.4外周血中NOS活性和NO水平測定與對照組相比，哮喘組NOS活性和NO含量明顯升高(P<0.01或P<0.001)。與哮喘組比較，氨茶堿組和WYKHM藥物高、中、低劑量組NO、NOS水平均降低(P<0.001)。見表2。

表1　外周血WBC和細胞分類百分比

與對照組比較：1)P<0.01;與哮喘組比較：2)P<0.01

2.5外周血中SOD活性和MDA水平測定由表4可見，與對照組相比，哮喘組SOD活性明顯降低，MDA水平明顯升高(P<0.01或P<0.05)；氨茶堿組和WYKHM藥物高中低劑量組均能提高外周血中SOD活性，降低MDA水平，與哮喘組比較(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2　外周血中各指標水平比較

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.001;與哮喘組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3討論

哮喘病嚴重影響了人們生活狀況和生活質量。IL-5是嗜酸細胞炎癥的關鍵調控因子，通過對EOS募集、遷移入氣道并維持炎癥反應的正向調控作用，使支氣管黏膜產(chǎn)生特征性改變并激活EOS，產(chǎn)生活性氧自由基及花生四烯酸代謝產(chǎn)物，損傷氣道，造成氣道高反應性〔4〕。IL-23由活化的樹突細胞(DC)和巨噬細胞(Mφ)分泌產(chǎn)生，由一個新的蛋白p19與IL-2中的亞基p40組成〔5〕。IL-23可以直接激活巨噬細胞和樹突狀細胞產(chǎn)生IL-23R，促進腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1炎性介質的產(chǎn)生，進一步促進IL-23依賴和非依賴途徑的慢性炎癥反應和細胞免疫反應〔6〕。作為血管內皮舒張因子，NO可以舒張支氣管平滑肌緩解哮喘，隨病情進展，NO合成增加超過一定限度便產(chǎn)生毒副作用，如擴張氣道黏膜血管、增強滲出、誘發(fā)氣道黏膜水腫〔7〕。NO與O2-生成過氧亞硝基陰離子并能衍生多種其他氧化劑，導致氣道上皮細胞損傷，是哮喘氣道高反應性形成的主要原因〔8〕。哮喘期間具有抗氧化作用的酶，如SOD的活性迅速丟失，導致大量毒性氧化產(chǎn)物在氣道內聚集，導致MDA水平升高，SOD活性下降〔9〕。

4參考文獻

1雷永紅.支氣管哮喘發(fā)病機制中細胞因子作用的研究〔J〕.九江學院學報(自然科學版)，2013；1(1)：72-4.

2劉穎慧，蔣捍東.變應性鼻炎和哮喘患者血清IL-5，IL-15及IL-18的水平研究〔J〕.國際免疫學雜志，2010；33(6)：495.

3張云峰，趙凱姝，張波，等.哮喘鼠白細胞介素23水平變化及其作用機制〔J〕.吉林大學學報：醫(yī)學版，2009；35(4)：681-4.

4Walsh GM.Antagonism of eosinophil accumulation in asthma〔J〕.Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov,2010；4(3):210-3.

5Oppmann B，Lesley R，Blom B,etal.Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine,IL-23,with biological activities similar as well as distinct from IL-12〔J〕.Immunity,2002；13(5):715-25.

6Iwakμra Y，Ishigame H.The IL-23/IL-17 axis in inflammation〔J〕.J Clin Invest，2006，116(5): 1218-22.

7沈劍虹，張文挺，劉艷茹，等.一氧化氮在支氣管哮喘中的作用及臨床意義〔J〕.內蒙古醫(yī)學雜志，2010，42(5)：575-577.

8韓向莉，婁志杰.支氣管哮喘發(fā)病機制及治療研究新進展〔J〕.四川中醫(yī)，2014，32(4)：186-9.

9孟逸萍.支氣管哮喘患者血清SOD、NO水平檢測的臨床意義〔J〕.吉林醫(yī)學，2010，31(32)：5780.

〔2014-02-18修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)