睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)糖尿病大鼠海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)及認(rèn)知功能的影響

黃薇楊巧劉霞張莉夏麗肖謙

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年科，重慶400016)

摘要〔〕目的探討睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)對(duì)糖尿病(DM)大鼠海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)表達(dá)及認(rèn)知功能的影響及機(jī)制。方法50只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、DM組、DM+DMSO組、DM+CNTF組和DM+CNTF+AG490組，每組10只。腹腔注射建立鏈脲佐菌素(STZ)DM大鼠模型，Open-field實(shí)驗(yàn)排除抑郁DM大鼠，Morris水迷宮測(cè)試大鼠逃避潛伏期和穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)，Western印跡以及免疫組化檢測(cè)大鼠海馬ChAT蛋白水平，RT-PCR檢測(cè)ChAT mRNA水平。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，DM組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05),穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)減少(P<0.05)，海馬部位ChAT mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與DM組相比，DM組+CNTF組大鼠逃避潛伏期時(shí)間及穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)的成績(jī)明顯改善(P<0.05),海馬部位ChAT mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。結(jié)論CNTF對(duì)DM大鼠認(rèn)知功能有改善作用，其機(jī)制可能與通過(guò)JAK2/STAT3途徑上調(diào)ChAT mRNA和蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；糖尿病腦??；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；認(rèn)知功能

中圖分類號(hào)〔〕R587.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81170752)；重慶市自然科學(xué)基金CSTC(2010BB5396)；重慶市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(重點(diǎn))(2010-1-8)

通訊作者：肖謙(1956-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事老年內(nèi)分泌代謝研究。

第一作者：黃薇(1984-)，女，在讀碩士，醫(yī)師，主要從事老年內(nèi)分泌代謝研究。

Effects of ciliary neurotrophic factor on the expression of choline acetyltransferase in hippocampus and the cognitive function of diabetic rats

HUANG Wei，YANG Qiao, LIU Xia,etal.

Department of Geriatrics,the First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of ciliary neurotrophic factor(CNTF) on the expression of choline acetyltransferase (ChAT) in hippocampus and cognitive function of diabetic mellitus(DM), and explore its possible mechanism.Methods50 SD male rats were meanly divided into normal, DM, DM+DMSO, DM+CNTF, DM+CNTF+AG490 groups randomly. Streptozotocin-diabetic rats model were established, diabetic rats with depression were screened by open-field test. Escape latency and frequency of entrance into the target zone were measured by Morris water maze. The mRNA and protein levels of ChAT were examined with RT-PCR，Western blot and immunohistochemistry.ResultsCompared to that of normal group，escape latency was increased and frequency of entrance into the target zone was decreased significantly in DM,DM+DMSO and DM+CNTF+AG490 groups(P<0.05),the mRNA and protein levels of ChAT in hippocampal were decreased significantly(P<0.05) .The scores of escape latency and frequency of entrance into the target zone were highly improved in DM+CNTF group，the mRNA and protein expressions of ChAT in hippocampal were increased markedly than those of DM group(P<0.05) .ConclusionsCNTF could improve cognitive ability of DM rats by increasing the mRNA and protein expressions of ChAT through the JAK2/STAT3 pathway.

【Key words】Ciliary neurotrophic factor; Diabetic encephalopathy; Choline acetyltransferase；Cognition

睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、功能維持和損傷修復(fù)有密切的關(guān)系，是一種能夠促進(jìn)多種神經(jīng)細(xì)胞存活，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化和損傷修復(fù)中具有重要作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。CNTF對(duì)阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變及周圍神經(jīng)病變等均有改善作用，但對(duì)糖尿病認(rèn)知功能障礙發(fā)病過(guò)程有無(wú)影響至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬觀察 CNTF對(duì)糖尿病(DM)大鼠海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)表達(dá)水平及認(rèn)知功能的影響，探討DM認(rèn)知功能障礙可能的發(fā)病機(jī)制。

1材料與方法

1．1材料鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó)Sigma公司)；血糖儀(德國(guó)拜耳公司)；大鼠腦立體定位儀(美國(guó)Stoelting公司)；Morris水迷宮及水迷宮記錄分析系統(tǒng) (中國(guó)淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司研制)；CNTF(美國(guó)PeproTech公司)；兔抗大鼠ChAT多克隆抗體(abcam公司)；AG490(美國(guó)Sigma公司)；RNA總抽提試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，DNA marker DL500(TaKaRa公司)；引物合成:上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2方法

1．2．1動(dòng)物分組與處理SPF級(jí)Spraque-Dawley(SD)雄性大鼠50只,8～10周齡,體重180～220 g,購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物適應(yīng)喂養(yǎng)1 w后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)、DM組、DM+二甲基亞砜(DMSO)組、DM+CNTF組和DM+CNTF+AG490組，每組10只，注射STZ建立DM模型。成模后第11周,各組均進(jìn)行礦場(chǎng)(Open-field)實(shí)驗(yàn),排除抑郁DM大鼠。隨后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試,測(cè)試結(jié)束后給予各組大鼠側(cè)腦室注射，持續(xù)注射1 w后,所有實(shí)驗(yàn)大鼠再次進(jìn)行水迷宮測(cè)試。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)DM+CNTF+AG490組大鼠死亡1只。

1．2．2Open-field實(shí)驗(yàn)以穿越底面的格數(shù)及后肢站立次數(shù)記錄水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)，了解大鼠的活動(dòng)度及其對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度,并計(jì)數(shù)修飾次數(shù)。

1．2．3Morris水迷宮測(cè)試DM模型建模成功后第11周,訓(xùn)練3 d,第4天進(jìn)行隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn),分析潛伏期,測(cè)試學(xué)習(xí)能力。第5天撤去平臺(tái)進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，去除平臺(tái)觀察2 min內(nèi)大鼠通過(guò)原平臺(tái)的次數(shù),測(cè)試記憶能力。CNTF及AG490干預(yù)1 w后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1．2．4CNTF干預(yù)成模后第11周,各組大鼠水迷宮測(cè)試完畢即予CNTF及AG490干預(yù)。大鼠經(jīng)4%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,沿顱頂正中線剪開(kāi)頭皮暴露顱骨,大鼠側(cè)腦室穿刺坐標(biāo)〔1,2〕:前囟后1.0 mm,右1.5 mm,深3.5 mm。微型電鉆沿此穿刺點(diǎn)鉆孔。將帶內(nèi)芯的不銹鋼套管(外徑0.86 mm,內(nèi)徑 0.5 mm)垂直插入側(cè)腦室內(nèi),牙托粉黏合固定套管,凝固后縫合傷口。術(shù)后大鼠予以青霉素抗炎并分籠飼養(yǎng)。導(dǎo)管置入后第4天進(jìn)行側(cè)腦室注射。①正常對(duì)照組和DM組注射等量生理鹽水；②DM+DMSO組注射等量2.99%DMSO(<3%)；③DM+CNTF組：微量注射器3 min內(nèi)將CNTF(0.5 nmol/L,2 μl)〔3〕緩慢勻速注入側(cè)腦室，留針約1 min；④DM+CNTF+AG490組：微量注射器3 min內(nèi)將CNTF(0.5 nmol/L,2 μl)和AG490(29 nmol/L,2 μl)〔4〕緩慢勻速注入側(cè)腦室，留針約1 min；各組大鼠每天給藥1次，連續(xù)7 d。

1．2．5RT-PCR法大鼠斷頭,低溫下快速取出海馬組織,液氮凍存。按RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)提取海馬的總RNA。ChAT上游引物序列5'CCAGTTCTTTGTCTTGGATGTT3′，下游引物序列5'GGACGCCATTTTGACTATCTTT3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為94 bp；β-actin上游引物序列5'CACCCGCGAGTACAACCTTC3′，下游引物序列5'CCCATACCCACCATCACACC3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為207 bp。反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，pre-Taq PCR 12 μl，ddH2O 9 μl。 ChAT反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃ 30 s，56.3℃退火40 s，72℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min;4℃保存。β-actin反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 2 min;94℃ 30 s，57.8℃退火40 s，72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min;4℃保存。取上述PCR產(chǎn)物5 μl用2% 瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。凝膠成像分析系統(tǒng)掃描 RT-PCR電泳結(jié)果,Quantity One軟件測(cè)定Volumn值,計(jì)算ChAT /β-actin比值。

1．2．6Western 印跡稱取-80℃冰箱保存的海馬組織100 mg，加入0.2 ml RIPA和2 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)，超聲細(xì)胞破碎儀低溫勻漿，離心后二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，免疫印跡，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影后條帶經(jīng)凝膠成像軟件分析，以ChAT/β-actin條帶灰度比值表示ChAT蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1．2．7免疫組化采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法。處死大鼠,1%多聚甲醛心臟灌注取腦,石蠟包埋連續(xù)冠狀切片,根據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè) ChAT在各組大鼠海馬的表達(dá)。

2結(jié)果

2．1Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果DM組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組逃避潛伏期增加,與正常對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。DM+CNTF組較DM組逃避潛伏期明顯縮短，通過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)明顯增加(P<0.05),與正常對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2．2ChAT mRNA及蛋白的表達(dá)與正常對(duì)照組比較，DM 組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組 ChAT mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與 DM 組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組比較，DM +CNTF組ChAT mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1，圖2，表2。

2．3免疫組化結(jié)果與正常對(duì)照組相比，DM組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組海馬 ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元明顯降低；DM+CNTF組與DM組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組比較,上述指標(biāo)明顯增加,但仍少于正常對(duì)照組。見(jiàn)圖3，表2。

表1　大鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)及隱蔽平臺(tái)搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ± s)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05,；與DM組比較：2)P<0.05;與DM+CNTF組比較：3)P<0.05；下表同

M:Markers;A:正常對(duì)照組；B:DM組；C:DM+DMSO組；D:DM+CNTF組；E:DM+CNTF+AG490組；下圖同 圖1　各組大鼠海馬區(qū)ChAT mRNA的表達(dá)

圖2　Western印跡檢測(cè)各組大鼠海馬ChAT蛋白表達(dá)

組別nChAT/β-actin(mRNA)ChAT/β-actin(蛋白)ChAT平均光密度正常對(duì)照組100.74±0.050.29±0.030.24±0.01DM組100.27±0.021)3)0.17±0.021)3)0.17±0.021)DM+DMSO組100.27±0.021)3)0.17±0.011)3)0.18±0.021)DM+CNTF組100.51±0.031)0.26±0.011)0.23±0.011)DM+CNTF+AG490組90.26±0.021)3)0.17±0.021)3)0.17±0.021)3)

圖3　各組大鼠海馬區(qū)ChAT免疫組化染色結(jié)果(×400)

3討論

CNTF因最初從雞的睫狀神經(jīng)節(jié)中提取出來(lái)而得名，屬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員，是目前公認(rèn)的影響大腦認(rèn)知功能的一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，主要分布在成人大腦的海馬顆粒下層。細(xì)胞培養(yǎng)顯示，CNTF對(duì)基底前腦膽堿能等多種神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)作用，并通過(guò)激活Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2/STAT3)途徑發(fā)揮作用。乙酰膽堿是影響認(rèn)知功能的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，ChAT作為膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)合成過(guò)程中最關(guān)鍵的酶，直接決定生物體內(nèi)乙酰膽堿的含量，是調(diào)節(jié)認(rèn)知功能的重要蛋白質(zhì)。前期研究證實(shí)，糖尿病認(rèn)知功能障礙早期基底前腦、海馬等處膽堿能神經(jīng)元存在明顯退行性改變，ChAT表達(dá)減少〔5〕，提示ChAT的差異性表達(dá)參與了DM認(rèn)知功能障礙的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

本研究通過(guò)建立DM大鼠模型，發(fā)現(xiàn)成模后DM大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降,認(rèn)知功能已經(jīng)受損，ChAT可能參與此過(guò)程；側(cè)腦室注射外源性CNTF后，DM大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力明顯改善，可能與上調(diào)海馬區(qū)ChAT表達(dá)水平有關(guān)；本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CNTF作用被JAK2拮抗劑AG490阻斷后,大鼠水迷宮測(cè)試潛伏期延長(zhǎng),穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)減少,但海馬區(qū)ChAT mRNA和蛋白表達(dá)量仍較對(duì)照組顯著降低，提示CNTF上調(diào)海馬區(qū)ChAT mRNA和蛋白表達(dá)，改善DM大鼠認(rèn)知功能障礙的效應(yīng)部分是通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。除此以外，CNTF改善DM大鼠認(rèn)知功能的作用還可能存在其他機(jī)制。CNTF能緩解腦缺血造成的空間認(rèn)知障礙，組織學(xué)研究顯示皮質(zhì)的梗死灶和同側(cè)丘腦神經(jīng)元逆行性變形均有改善；CNTF對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、海馬膽堿能神經(jīng)元及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元等均有促進(jìn)存活及防止損傷的作用。

綜上所述，我們有理由推測(cè)CNTF至少部分通過(guò)JAK2/STAT3途徑〔6~9〕，改善神經(jīng)元退行性變化，上調(diào)海馬區(qū)ChAT表達(dá)水平，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的合成，這可能是其改善DM認(rèn)知功能障礙的又一重要途徑。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-12-17修回〕

(編輯袁左鳴/徐杰)