吳曉翠，陳壬寅，張　嵐，孟　輝

(1.河南省人民醫(yī)院放療科，河南 鄭州 450003；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052)

乳腺導(dǎo)管原位癌和早期微浸潤癌灶中HER-2/neu癌基因擴(kuò)增及其臨床意義

吳曉翠1，陳壬寅2，張嵐2，孟輝2

(1.河南省人民醫(yī)院放療科，河南 鄭州 450003；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052)

[摘要]目的探討HER-2/neu癌基因在乳腺導(dǎo)管原位癌及早期微浸潤灶中的擴(kuò)增情況及臨床意義。方法采用FISH法檢測了存檔的168例乳腺癌石蠟包埋組織標(biāo)本HER-2/neu基因的擴(kuò)增情況。結(jié)果單純導(dǎo)管原位癌9例，導(dǎo)管原位癌伴早期微浸潤癌83例，浸潤性導(dǎo)管癌29例，小葉原位癌6例，浸潤性小葉癌41例。單純導(dǎo)管原位癌病例中HER-2/neu基因擴(kuò)增率66.7%(6/9)；導(dǎo)管原位癌伴早期微浸潤病例中HER-2/neu基因擴(kuò)增率61.4%(51/83)；浸潤性導(dǎo)管癌中HER-2/neu基因擴(kuò)增率34.5%(10/29)；小葉原位癌HER-2/neu基因擴(kuò)增率0.0%(0/6)；浸潤性小葉癌中HER-2/neu基因擴(kuò)增率12.2%(5/41)。結(jié)論HER-2/neu基因在導(dǎo)管原位癌和早期微浸潤病灶中擴(kuò)增狀態(tài)無明顯差異，導(dǎo)管旁微浸潤病灶中HER-2/neu基因擴(kuò)增情況基本與導(dǎo)管內(nèi)一致；導(dǎo)管癌HER-2/neu基因擴(kuò)增率高于小葉癌。

[關(guān)鍵詞]乳腺癌；HER-2/neu；導(dǎo)管原位癌；微浸潤

在美國，乳腺導(dǎo)管原位癌Ⅲ級占新診斷乳腺癌的12%～14%，50%未經(jīng)治療的原位癌在24 a內(nèi)均發(fā)展成為同側(cè)浸潤性乳腺癌。但目前其浸潤發(fā)生的生物機(jī)制人們還未完全理解。HER-2/neu基因通常在正?；蛄夹匀橄俨∽冎胁怀蔬^度表達(dá)，而在原位癌病變中呈過度表達(dá)。HER-2/neu基因的表達(dá)在侵襲性癌中比原位癌中大大降低[1-2]。但很少研究比較HER-2/neu基因在乳腺導(dǎo)管原位癌與乳腺導(dǎo)管原位癌合并浸潤癌組織中的表達(dá)[1,3-5]。原位癌組織中過度表達(dá)的HER-2/neu基因是否參與或決定了腫瘤惡性侵襲性及原位癌向浸潤癌的發(fā)展尚未得到證實。本研究中，我們對照研究了HER-2/neu基因在乳腺導(dǎo)管原位癌和早期導(dǎo)管微浸潤灶癌中擴(kuò)增的頻率。其評價可能幫助識別存在進(jìn)一步惡變潛能的原位癌，并為赫賽汀預(yù)防干預(yù)治療提供潛在的分子靶標(biāo)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源及入選標(biāo)準(zhǔn)選擇2009年9月至2011年12月我院乳腺外科手術(shù)切除的乳腺癌組織標(biāo)本168例，患者年齡(46.0±2.7)歲；導(dǎo)管原位癌9例，導(dǎo)管內(nèi)癌伴早期微浸潤83例，浸潤性導(dǎo)管癌29例，小葉原位癌6例，浸潤性小葉癌41例。然后對每個原位癌病灶進(jìn)行分級。

1.2FISH法檢測HER-2/neu基因擴(kuò)增FISH法參照原位雜交試劑盒說明書進(jìn)行，略加改進(jìn)。HER-2/neu熒光原位雜交探針由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供。使用前，DNA探頭先于病例組與對照組的HE染色標(biāo)本中找到有乳腺導(dǎo)管原位癌區(qū)域及浸潤的癌灶部位。在找到的癌灶部位對標(biāo)志基因進(jìn)行檢測。具體步驟：切片預(yù)處理4～5 μm石蠟切片65 ℃烤片3 min，常規(guī)脫蠟至水，滴加已復(fù)溫的酶預(yù)處理液，室溫孵育5～10 min，蒸餾水洗3次，每次2 min，中性甲醛室溫固定10 min。梯度乙醇脫水(75%,85%,100%乙醇各2分鐘脫水)，自然干燥或電吹風(fēng)吹30S。變性與雜交:每片滴加10 μL HER-2/neu探針混合物，立即用專用雜交蓋片覆蓋81 ℃ 變性6～10 min，42 ℃，雜交過夜(超過10 h)；洗滌:浸入0.4×SSC/0.3% NP-40洗滌液1.5 min，后浸入2×SSC/0.1% NP-40洗滌液0.5 min。70%乙醇洗滌5 min，自然干燥。10～15 μL DAPI復(fù)染。

1.3熒光顯微鏡判讀標(biāo)準(zhǔn)以萊卡DMBRX熒光顯微鏡，顯微鏡由DAPI，綠色光譜，橘色光譜3通道濾過光源觀察3種不同熒光信號。以FISH3.0成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像獲取及處理。紅色信號代表HER-2/neu基因，綠色信號代表17號染色體著絲粒探針。以紅綠信號比值來判斷HER-2/neu基因擴(kuò)增狀況。比值<2.0為無擴(kuò)增，比值≥2.0為基因擴(kuò)增，紅信號顯示密集以致無法辨認(rèn)為簇狀擴(kuò)增[5]。首先在HE染色切片上確認(rèn)浸潤性癌區(qū)域，然后在10倍物鏡下，于FISH切片上相同的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，要求至少找到2個浸潤性癌區(qū)域。然后在40倍物鏡下掃描整張切片，觀察是否存在HER-2/neu表達(dá)的異質(zhì)性以及切片的質(zhì)量，再于100倍物鏡下通過特異單通道濾光片觀察癌細(xì)胞核的FISH結(jié)果。每個靶視野計數(shù)60個腫瘤細(xì)胞核信號。

1.4微浸潤灶尋找方法乳腺浸潤癌是WHO(2003)乳腺腫瘤組織中分類提出的新名稱，是指在大量導(dǎo)管內(nèi)癌背景下，乳腺(非特化的小葉)間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)一個或幾個鏡下明確分離的微小浸潤灶。浸潤癌多為浸潤性導(dǎo)管癌。單個浸潤性病灶最大直徑不超過2 mm，或者有2～3個浸潤灶，每個最大直徑不超過1 mm。首先在HE染色切片上確認(rèn)導(dǎo)管內(nèi)癌及微浸潤灶成份，結(jié)合HER-2/neu指標(biāo)免疫組化結(jié)果，及結(jié)合SMA、CK5/6、Calponin、P63、S-100等免疫組化指標(biāo)確認(rèn)導(dǎo)管完整性及幫助辨認(rèn)導(dǎo)管旁微浸潤成分，并注意尋找脂肪等間葉成分中浸潤的少量癌細(xì)胞。再于100倍物鏡下通過特異單通道濾光片觀察腫瘤細(xì)胞核的FISH結(jié)果。每個靶視野計數(shù)60個腫瘤細(xì)胞核信號。

1.5基因擴(kuò)增率計算基因擴(kuò)增率按照以下公式計算：HER-2/neu陽性病例數(shù)目/HER-2/neu陰性病例數(shù)目。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，全部分組標(biāo)志定量數(shù)據(jù)以±s表示，比較采用單因素方差分析和t檢驗；定性數(shù)據(jù)以百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1大體觀察結(jié)果168例乳腺癌標(biāo)本中，導(dǎo)管內(nèi)癌9例，腫塊直徑為1.2～9.0 cm，均未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；導(dǎo)管內(nèi)癌伴微浸潤83例，腫塊直徑0.6～16.0 cm，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.2光學(xué)顯微鏡下觀察情況導(dǎo)管原位癌表現(xiàn)為：乳頭狀、粉刺癌、實性、篩性、微乳頭狀等。導(dǎo)管顯著擴(kuò)大，細(xì)胞有明顯多形性和異型性，排列紊亂極向消失。導(dǎo)管原位癌級別依據(jù)2012年版WHO乳腺腫瘤組織分類。低級別：核只有輕度多形性和異型性，無壞死。中級別：核有輕度多形性，和異型性伴或不伴壞死。高級別：核有明顯細(xì)胞學(xué)異型性及高分裂活性及壞死。經(jīng)典型小葉癌組織學(xué)特點為：膨大的腺管內(nèi)充滿均勻一致的瘤細(xì)胞；細(xì)胞通常較小，形態(tài)溫和，圓或多邊形，核深染，無明顯核仁，可有核溝；細(xì)胞漿較少，細(xì)胞輪廓不清，核分裂象、壞死及鈣化少見。微小浸潤灶為浸潤性導(dǎo)管癌，伴有導(dǎo)管周圍炎細(xì)胞和硬化性間質(zhì)。腺管基膜和肌上皮可不完整。浸潤成分缺乏肌上皮。

2.3HER-2/neu基因擴(kuò)增結(jié)果單純導(dǎo)管原位癌病例中，3例為擴(kuò)增，擴(kuò)增病例均為高級別導(dǎo)管原位癌，6例為無擴(kuò)增；無擴(kuò)增病例中2例為低級別導(dǎo)管原位癌，1例為乳頭狀癌(表1)。83例導(dǎo)管內(nèi)癌伴早期微浸潤病例中，33例為簇狀擴(kuò)增(圖1)，其中14例為17號染色體多倍體，余為整倍體；18例為點狀擴(kuò)增(圖2)，其中1例為17號染色體單倍體，6例為17號染色體多倍體(圖3)，余為整倍體。32例未擴(kuò)增病例中，2例為17號染色體多倍體，余為整倍體。所有擴(kuò)增病例中，40例為高級別導(dǎo)管原位癌，且微浸潤癌灶絕大多數(shù)(49/51,96.1%)與導(dǎo)管原位癌同時擴(kuò)增，微浸潤癌灶未擴(kuò)增的2例(2/51,3.9%)表現(xiàn)為導(dǎo)管內(nèi)癌成分小部分為HER-2/neu基因擴(kuò)增，大部分為HER-2/neu基因未擴(kuò)增。除這2例導(dǎo)管原位癌為部分?jǐn)U增的病例表示導(dǎo)管原位癌擴(kuò)增狀態(tài)外，其余均表示導(dǎo)管原位及微浸潤癌部分的共同的擴(kuò)增狀態(tài)。

在擴(kuò)增病例中，導(dǎo)管原位癌的HER-2/neu基因的平均擴(kuò)增率與導(dǎo)管內(nèi)癌伴早期微浸潤病例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；導(dǎo)管原位癌HER-2/neu基因的平均擴(kuò)增率高于小葉原位癌，浸潤性導(dǎo)管癌HER-2/neu基因的平均擴(kuò)增率高于浸潤性小葉癌(P<0.05)。

表1　乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和早期浸潤癌HER-2/neu基因擴(kuò)增比較　n(%)

圖1　乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌伴早期微浸潤癌灶HER-2/neu基因擴(kuò)增情況

圖2　乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌伴早期微浸潤癌灶HER-2/neu基因點狀擴(kuò)增情況 (FISH,×1 000)

圖3　導(dǎo)管內(nèi)HER-2/neu基因表達(dá)情況(FISH,×1 000)

A：HER-2/neu基因顯示簇狀擴(kuò)增(橘紅色信號)，17號染色體多倍體，簇狀表達(dá)(綠色信號)；B：導(dǎo)管內(nèi)HER-2/neu基因顯示簇狀擴(kuò)增，17號染色體二倍體

3討論

約20%～25%的乳腺癌患者呈HER-2/neu過表達(dá)或基因擴(kuò)增，其生物學(xué)行為惡性度高，預(yù)后不良。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，對原癌基因HER-2/neu的研究及其相關(guān)治療已越來越受到重視[6]。本研究采用熒光原位免疫雜交的方法檢測了存檔案的92例乳腺癌石蠟包埋組織標(biāo)本，其中單純導(dǎo)管原位癌9例，導(dǎo)管內(nèi)癌伴早期微浸潤83例。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)管內(nèi)癌伴早期微浸潤癌灶中，導(dǎo)管旁微浸潤病灶中HER-2/neu的表達(dá)與同一病例中導(dǎo)管內(nèi)成份較一致。所有導(dǎo)管內(nèi)癌伴微浸潤的擴(kuò)增病例中，微浸潤癌灶絕大多數(shù)(49/51,96.1%)與導(dǎo)管內(nèi)癌同時擴(kuò)增。微浸潤癌灶未擴(kuò)增的2例病例表現(xiàn)為導(dǎo)管內(nèi)癌成分大部分未擴(kuò)增，小部分?jǐn)U增。未發(fā)現(xiàn)微浸潤癌灶HER-2/neu基因單獨擴(kuò)增的情況，即導(dǎo)管內(nèi)癌組織成份HER-2/neu基因擴(kuò)增的生物學(xué)行為可能早于微浸潤癌灶，且與Latta等[6]發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致，HER-2/neu基因在導(dǎo)管原位癌中的表達(dá)高于導(dǎo)管旁微浸潤癌灶中的表達(dá)(本實驗未觀察到顯著統(tǒng)計學(xué)差異)，理論上微浸潤癌灶應(yīng)具有惡性程度高及侵襲性高的特征，但微浸潤癌灶的HER-2/neu基因較導(dǎo)管原位癌表達(dá)低的原因，HER-2/neu原癌基因在乳腺導(dǎo)管原位癌發(fā)展至浸潤癌過程中的生物學(xué)行為尚需進(jìn)一步臨床及基礎(chǔ)研究的證據(jù)。

導(dǎo)管原位癌，特別是高級別導(dǎo)管原位癌中HER-2/neu的過表達(dá)和擴(kuò)增比率較高(50%～60%)，本研究中導(dǎo)管原位癌中HER-2/neu擴(kuò)增比率為33.3%，可能原因為本研究統(tǒng)計樣本源為我院某時間段庫存單純導(dǎo)管原位癌，且只有9例，臨床上這種病例并不常見，大多伴有微浸潤成分。但研究發(fā)現(xiàn)單純導(dǎo)管原位癌中擴(kuò)增病例的HER-2/neu基因的平均擴(kuò)增率較導(dǎo)管內(nèi)癌伴早期微浸潤病例的HER-2/neu基因擴(kuò)增率高，由于樣本量(單純導(dǎo)管原位癌9例)原因，未作統(tǒng)計分析。

HER-2/neu 基因過度表達(dá)的乳腺癌惡性程度高，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)生早，預(yù)后差，對某些化療藥物有抵抗，且患者的無病生存和總生存期短。HER-2/neu基因作為獨立預(yù)后指標(biāo)，對于乳腺癌的預(yù)后評價及指導(dǎo)治療有極其重要的價值。HER-2/neu過表達(dá)型乳腺癌有其特殊的生物學(xué)特性，在乳腺癌的4個分子亞型中 HER-2/neu 過表達(dá)型乳腺癌腫瘤細(xì)胞侵襲力強(qiáng)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度高。

本研究中，除了觀察導(dǎo)管原位癌伴或不伴早期微浸潤的病例，研究者還同時觀察了其余病理類型HER-2/neu基因的擴(kuò)增情況，結(jié)果如下：浸潤性導(dǎo)管癌伴導(dǎo)管內(nèi)癌22例(浸潤性導(dǎo)管癌占大多數(shù)，伴導(dǎo)管內(nèi)癌成分，腫塊直徑0.6～9.0 cm)，導(dǎo)管內(nèi)癌伴浸潤性導(dǎo)管癌7例(導(dǎo)管內(nèi)癌占大多數(shù)，伴浸潤癌成分，直徑2～5 mm)，均未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；小葉原位癌6例(其中1例為導(dǎo)管原位癌與小葉原位癌并存，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，浸潤性小葉癌41例(大多為浸潤性小葉癌伴浸潤性導(dǎo)管癌)，腫塊直徑0.9～6.5 cm，可見前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為23.08%。22例浸潤性導(dǎo)管癌為主伴導(dǎo)管內(nèi)癌中7例HER-2/neu基因擴(kuò)增，擴(kuò)增率為31.81%。7例導(dǎo)管內(nèi)癌為主伴浸潤性導(dǎo)管癌中3例HER-2/neu基因擴(kuò)增，擴(kuò)增率為42.86%。研究發(fā)現(xiàn)小葉原位癌HER-2/neu表達(dá)普遍低于導(dǎo)管內(nèi)癌的HER-2/neu表達(dá)，且多為陰性表達(dá)，故無足夠FISH數(shù)據(jù)驗證HER-2/neu基因擴(kuò)增。浸潤性小葉癌HER-2/

neu蛋白表達(dá)低于浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)，且前者的HER-2/neu蛋白的表達(dá)多集中在0～+之間。小葉癌中HER-2/neu蛋白表達(dá)的低相關(guān)性是否與其高侵襲浸潤的生物學(xué)行為表現(xiàn)(如小葉癌E鈣黏素的低表達(dá)和高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率)不一致尚需進(jìn)一步探討。

本研究中關(guān)于HER-2/neu在導(dǎo)管內(nèi)癌伴或不伴微浸潤組織中的FISH研究將幫助確認(rèn)臨床難以診斷的疑似微浸潤的部位，以指導(dǎo)臨床治療。HER-2/neu基因在乳腺導(dǎo)管原位癌中及其伴早期微浸潤癌灶中的擴(kuò)增的評價可能幫助識別存在進(jìn)一步惡變潛能的原位癌，并為赫賽汀預(yù)防干預(yù)治療提供潛在的分子靶標(biāo)。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.05.002

[中圖分類號]R737.9；R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1673-5412(2015)05-0372-05

(收稿日期：2015-06-13)

Role of HER2/neu Amplification in the Pure Ductal
Carcinoma in Situ and Micro Invasive Ductal Carcinoma of the Breast

Wu Xiaocui1,Chen Renyin2,Zhang Lan2,Meng Hui2

(1.DepartmentofRadiotherapy,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003,China;

2.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the HER2/neu gene amplification in pure ductal carcinoma in situ and micro invasive ductal carcinoma of the breast and the clinical significance.MethodsThe HER2/neu gene amplification in the 168 cases of breast cancer were detected by using FISH technology.ResultsPure ductal carcinoma in situ,micro invasive of ductal carcinoma in situ,invasive ductal carcinoma,lobular carcinoma in situ,invasive lobular carcinoma were 9,83,29,6,41 cases,respectively.The HER-2/neu amplification ratios were 66.7% (6/9) in pure ductal carcinoma in situ,61.4% (51/83) in micro invasive of ductal carcinoma in situ,34.5% (10/29) in invasive ductal carcinoma,0.0% (0/6) in lobular carcinoma in situ,12.2% (5/41) in invasive lobular carcinoma.ConclusionHER-2/neu gene amplification has no significant differences between pure ductal carcinoma in situ and micro invasive lesions;HER-2/neu expressions in pure ductal carcinoma in situ and micro invasive lesions are consentaneous in most samples.HER-2/neu gene amplification ratio was higher in ductal carcinoma than lobular cases.

[Key words]breast cancer;HER-2/neu;ductal carcinoma in situ;micro invasive