摘要：化學(xué)發(fā)光分析儀檢測的是微弱光信號，傳統(tǒng)的物理標準光源光強度往往超出其檢測范圍，難以用于計量校準。為此，該文建立并優(yōu)化兩種生物化學(xué)模擬發(fā)光標準體系。將8一羥基喹啉（8-Ox）引入魯米諾一過氧化氫一金屬離子體系中，實現(xiàn)發(fā)光方式由閃光型到輝光型的轉(zhuǎn)變，在lOOs內(nèi)發(fā)光值的相對標準偏差僅為1.1%；由此建立發(fā)光強度穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光標準體系，利用此體系考察化學(xué)發(fā)光分析儀的重復(fù)性、交叉污染、線性相關(guān)系數(shù)。利用三磷酸腺苷（ATP）-熒光素-熒光素酶反應(yīng)，建立生物發(fā)光標準體系，考察化學(xué)發(fā)光分析儀檢測靈敏度。為化學(xué)發(fā)光分析儀日常的校準工作以及固家計量校準規(guī)范的制訂提供實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鐵（Ⅲ）；8一羥基喹啉；三磷酸腺苷（ATP）；化學(xué)發(fā)光分析儀；計量校準

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5124（2015）03-0046-05

0 引言

化學(xué)發(fā)光是指在沒有光、電、磁、聲、熱源外來激發(fā)的情況下，僅由化學(xué)反應(yīng)提供能量而產(chǎn)生光輻射的現(xiàn)象?；瘜W(xué)發(fā)光分析儀是利用化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象進行物質(zhì)定性和定量分析的儀器，由于無需外部光源，避免了光源產(chǎn)生的瑞利散射、拉曼散射等背景干擾，大大提高了信噪比，具有靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測、藥物篩選、臨床診斷等領(lǐng)域。

由于化學(xué)發(fā)光過程所釋放的能量非常微弱，低于常規(guī)光學(xué)儀器檢測量程，所以難以通過光強度實現(xiàn)量值溯源。本文分別基于化學(xué)發(fā)光劑魯米諾（3-氨基鄰苯二甲酰肼）及ATP-熒光素-熒光素酶反應(yīng)，建立并優(yōu)化了兩種生化發(fā)光體系，信號強度適合化學(xué)發(fā)光分析儀的檢測范圍，具有清晰的量值溯源途徑。為化學(xué)發(fā)光分析儀的校準工作提供實驗基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

LB962型化學(xué)發(fā)光分析儀（德國伯托公司）；門色96孔板（美國康寧公司）。

魯米諾（Sigma-aldrich公司）；8-羥基喹啉（Sig-ma-aldriCh公司）；FeCl3（Sigma-ald rich公司）；過氧化氫（30%，Sigma-aldrich公司）；ATP生物發(fā)光檢測試劑盒（ENLITEN，美國普洛麥格公司）；實驗用水均為經(jīng)Milli-0（Millipore公司）純化的超純?nèi)ルx子水。實驗中所用試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 儲備液的配制

魯米諾儲備溶液：稱取一定量的魯米諾溶于1mol/L的NaOH溶液中，配制成lxl0^-2mol/L的魯米諾儲備液，儲存在棕色瓶中，避光4℃保存。

8-羥基喹啉儲備溶液：稱取一定量的8-羥基喹啉溶于0.1 mol/L的HCl溶液中，配制成lxl0^-2mol/L的8-羥基喹啉儲備液，4℃保存。

Fe（Ⅲ）標準儲備溶液：稱取一定量的烘干恒重的FeCl₃溶于pH2.5的HCl溶液中，配制成lxl0^-3mol/L的Fe（Ⅲ）標準儲備溶液，其摩爾濃度通過硫代硫酸鈉滴定法準確確定，通過GBW（E）081235硫代硫酸鈉滴定溶液標準物質(zhì)進行溯源。

ATP標準儲備溶液：稱取一定量的ATP標準物質(zhì)候選物溶于無ATP水（ATP生物發(fā)光檢測試劑盒自帶）中，配制成lxl0^-7mol/L的ATP標準儲備液，-20℃保存。作為實驗室研制的標準物質(zhì)候選物，需要按照ISO導(dǎo)則35要求，摩爾濃度經(jīng)過8家單位聯(lián)合驗證，并經(jīng)過一系列均勻性、穩(wěn)定性的考查。

1.2.2 工作溶液的配制

魯米諾工作溶液：用純水將魯米諾儲備液稀釋成lxl0^-3mol/L的魯米諾工作溶液（其中NaOH的摩爾濃度為0.1mol/L）。

8-羥基喹啉工作溶液：用純水將8-羥基喹啉儲備溶液稀釋成1xl0^-3mol/L的8-羥基喹啉工作液（其中HCl的摩爾濃度為0.01mol/L）。

Fe（Ⅲ）標準工作溶液：用pH 2.5的HCl溶液將Fe（Ⅲ）標準儲備溶液逐級稀釋成Fe （Ⅲ）標準工作溶液（lxl0^-4mol/L， 3xl0^-5mol/L， lxl0^-5mol/L，3×lO^-6mol/L，lxl0^-6mol/L）.

過氧化氫溶液：取一定量體積分數(shù)為30%的過氧化氫，用水稀釋至1%，用時現(xiàn)配。

ATP標準工作溶液：用檢測緩沖液（ATP生物發(fā)光檢測試劑盒自帶）將ATP標準儲備溶液逐級稀釋成ATP標準工作溶液（lxlO^-8mol/L，lxl0^-9mol/L、1×10^-10mol/L，lxl0^-11mol/L），現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 實驗方法

1）化學(xué)發(fā)光標準體系的建立

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)檢測：在1.5mL離心管中分別依次加入以下溶液，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中，進行動力學(xué)檢測，每秒取一個點，檢測時間共100s。

①10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLpH2.5的HCl溶液（相當于IOμLFe（lll）標準工作溶液）、85μLpH 2.0的HCl溶液（相當于85μL8一羥基喹啉工作溶液）；

②10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、IOμLFe（lll）標準工作溶液（3xl0^-5mol/L）、85μLpH 2.0的HCl溶液（相當于85μL 8-羥基喹啉工作溶液）；

③10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μL pH 2.5的HCl溶液（相當于IOμL Fe（lll）標準工作溶液）、85μL 8-羥基喹啉工作溶液；

④10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、1OμL Fe（Ⅲ）標準工作溶液（3xlO^-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液。

8-羥基喹啉的用量對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響：在10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μL Fe（Ⅲ）標準工作溶液（3xl0^-5mol/L）中分別加入不同體積的8一羥基喹啉工作溶液，并用pH 2.0的HCl溶液將體系補足205μL，立即檢測當前發(fā)光值。

pH對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響：在1.5mL離心管中依次加入10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、IOμL Fe（Ⅲ）標準工作溶液（3xlO^-5mol/L）、85μL的8一羥基喹啉工作溶液，利用HCl或NaOH調(diào)整體系的pH值，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測當前發(fā)光值。

反應(yīng)介質(zhì)對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響：在1.5mL離心管中分別加入50μL的Tris-HCl、H₃BO₃-KOH、Na₂C0₃-NaHC0₃和B-R緩沖溶液，然后分別依次加入10μL魯米諾工作溶液、100 μL過氧化氫溶液、IOμL Fe（lll）標準工作溶液（3xlO^-5mol/L）、85μL的8一羥基喹啉工作溶液，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測當前發(fā)光值。

2）生物發(fā)光標準體系的建立

用ATP標準物質(zhì)代替ATP生物發(fā)光檢測試劑盒中的ATP校準溶液，采用試劑盒中的其他溶液建立生物發(fā)光標準體系：首先，將10μL檢測緩沖液加入有100μL熒光素/熒光素酶試劑的1.5mL離心管中，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中進行檢測，作為背景信號；然后，將10μL ATP標準工作溶液加入有100μL熒光素/熒光素酶試劑的1.5mL離心管中，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中進行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)發(fā)光標準體系的建立

魯米諾（3-氨基鄰苯二甲酰肼）是最常見的化學(xué)發(fā)光試劑之一，具有發(fā)光效率高、結(jié)構(gòu)簡單、容易合成、水溶性好等優(yōu)點；在堿性條件下，魯米諾被氧化劑（如過氧化氫）氧化后能發(fā)出波長425nm的藍光。在不同體系中，魯米諾發(fā)光形式不同：金屬離子一過氧化氫一魯米諾體系是閃光型發(fā)光；辣根過氧化物酶（HRP）-過氧化氫-魯米諾體系是輝光型發(fā)光。HRP-魯米諾體系雖是輝光型發(fā)光，但生物酶的活性很難控制和復(fù)現(xiàn)，不適用于儀器的計量校準。本文將8-羥基喹啉（8-Ox）引入魯米諾一過氧化氫一金屬離子體系中，實現(xiàn)發(fā)光方式由閃光型到輝光型的轉(zhuǎn)變，建立了發(fā)光強度穩(wěn)定的魯米諾一過氧化氫一鐵（Ⅲ）-8-羥基喹啉化學(xué)發(fā)光標準體系。

2.1.1 添加8-羥基喹啉初步實現(xiàn)穩(wěn)定輝光型信號

魯米諾在堿性溶液中，與OH-反應(yīng)生成陰離子，該陰離子被某些氧化劑氧化產(chǎn)生氨基鄰苯二甲酸根離子，氧化過程中產(chǎn)生的化學(xué)能被氨基鄰苯二甲酸根離子吸收，使其處于激發(fā)態(tài)，回到基態(tài)時發(fā)出波長為425nm的光，F(xiàn)e（Ⅲ）可以催化該反應(yīng)過程，增強化學(xué)發(fā)光信號，而8-羥基喹啉可以與Fe（Ⅲ）絡(luò)合，從而起到穩(wěn)定劑的作用。圖l為不同體系中魯米諾-H₂0₂的發(fā)光情況，其縱坐標為相對發(fā)光強度（RIU）。曲線a說明魯米諾與H₂0₂混合后，被H₂0₂氧化并發(fā)光，剛開始發(fā)光值緩慢上升，隨著反應(yīng)物的消耗，發(fā)光值開始緩慢下降，發(fā)光形式呈現(xiàn)一個較平緩的閃光；曲線b說明在魯米諾-H₂0₂體系中加入了Fe （Ⅲ）之后，加速了魯米諾與H₂0₂反應(yīng)，因此一開始體系的發(fā)光就達到了最大值，之后隨著反應(yīng)物的快速消耗，發(fā)光值也急速下降；曲線c說明當在這個體系中加入8-羥基喹啉，F(xiàn)e（Ⅲ）與其絡(luò)合，保證了在堿性條件下Fe（Ⅲ）的穩(wěn)定性，使化學(xué)發(fā)光反應(yīng)變成非常平穩(wěn)的輝光型，在100s內(nèi)發(fā)光值的相對標準偏差僅為1.1%。曲線d是沒有Fe（Ⅲ）的空白對照實驗。

2.1.2 優(yōu)化反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

為獲得穩(wěn)定且容易操作的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系，選擇了IOμL魯米諾工作溶液（摩爾濃度為l×l0^-3mol/L）和100μL過氧化氫溶液（體積分數(shù)濃度為1%）的基礎(chǔ)上，考察8一羥基喹啉的用量、反應(yīng)體系最終pH和反應(yīng)介質(zhì)3個方面的因素，最終確定了該化學(xué)發(fā)光體系優(yōu)化濃度比例。

1）8-羥基喹啉的用量對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響。從圖2可以看出，隨著向體系中加入8-羥基喹啉工作溶液的增多，體系的發(fā)光值持續(xù)降低，直到當加入50μL 8-羥基喹啉工作溶液，體系的發(fā)光值不再隨著8一羥基喹啉加入量的增加而降低。在儀器計量工作中，可以選擇加入50-85μL 8-羥基喹啉工作溶液，此時8-羥基喹啉的體積對發(fā)光強度的影響最小。在后續(xù)實驗中，選擇65μL作為優(yōu)化的8-羥基喹啉加入量。

2）反應(yīng)體系最終pH對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響。魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)需要OH-的參與，因此體系的pH也是影響發(fā)光值的重要因素之一。由圖3可見，當pH>IO.O，體系的發(fā)光值會隨著pH增大而呈指數(shù)增加，體系不容易控制；當pH值在8.80-9.60范圍內(nèi)，體系的發(fā)光值增長比較穩(wěn)定，可以滿足儀器計量檢定中操作方便的需求。

3）緩沖體系對體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響?？疾炝讼嗤瑵舛鹊腡ris-HCl、H₃80₃-KOH、Na₂C0₃-NaHC0₃和B-R緩沖溶液對魯米諾一過氧化氫一鐵（Ⅲ）-8-羥基喹啉化學(xué)發(fā)光體系的影響，發(fā)現(xiàn)Tris-HCl中化學(xué)發(fā)光信號最為穩(wěn)定，故選擇Tris-HCl緩沖溶液；最終體系定為：加入50μL 0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液，pH=9.10。

通過對8一羥基喹啉的用量、反應(yīng)體系最終pH和反應(yīng)介質(zhì)3個方面的考查，確定了化學(xué)發(fā)光分析儀計量用魯米諾一過氧化氫一鐵（Ⅲ）-8-羥基喹啉體系，其用量分別為：10μL摩爾濃度為1xl0^-3mol/L魯米諾工作溶液（pH 13.0）、100μL體積分數(shù)為1%過氧化氫溶液、65μL摩爾濃度為lxl0^-3mol/L8-羥基喹啉工作溶液（pH 2.0）、和50μL 0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH=9.10）。此時化學(xué)發(fā)光強度與Fe（Ⅲ）的摩爾濃度具有很好的線性關(guān)系。

2.2 生物發(fā)光標準體系的建立

在眾多生物發(fā)光體系中，ATP-熒光素-熒光素酶發(fā)光體系應(yīng)用最為廣泛，ATP檢測也經(jīng)常被業(yè)內(nèi)用于化學(xué)發(fā)光分析儀靈敏度的衡量指標。其原理是：熒光素酶在有氧條件下，可以和熒光素結(jié)合后催化ATP轉(zhuǎn)化成AMP（磷酸腺苷），同時釋放出光子（波長562nm），發(fā)光效率高，而且發(fā)光強度與ATP含量呈很好的線性關(guān)系。為了統(tǒng)一儀器靈敏度的評價方法，我們研制了ATP標準物質(zhì)，并結(jié)合商品化ATP檢測試劑盒，建立了一套穩(wěn)定可靠的ATP生物發(fā)光標準體系，用于化學(xué)發(fā)光分析儀的計量校準。

2.3 生物化學(xué)發(fā)光標準體系在儀器計量校準中的應(yīng)用

最終將化學(xué)發(fā)光標準體系和生物發(fā)光標準體系聯(lián)合，共同對化學(xué)發(fā)光分析儀進行計量校準研究，對儀器的計量性能進行全面的考察：采用魯米諾一過氧化氫一鐵（Ⅲ）-8-羥基喹啉化學(xué)發(fā)光標準體系對伯托LB962型化學(xué)發(fā)光分析儀的測量重復(fù)性、交叉污染和線性相關(guān)系數(shù)的計量特性進行評價；采用ATP生物發(fā)光標準體系作為標準光源對伯托LB962型化學(xué)發(fā)光分析儀的靈敏度的計量特性進行評價。

2.3.1 測量重復(fù)性

以lxl0-5mol/L Fe（Ⅲ）標準工作溶液進行測量，重復(fù)測量6次，相對發(fā)光強度值分別為302579，298800，321145，299523，338856，356041，計算其相對標準偏差為7.4%，即為儀器的測量重復(fù)性。實驗數(shù)據(jù)說明儀器測量重復(fù)性較好；同時也說明建立的化學(xué)發(fā)光標準反應(yīng)體系發(fā)光值穩(wěn)定，完全可以用于儀器測量重復(fù)性的計量特性的評價。

2.3.2 交叉污染

測量中心孔（樣品位置，lxlO^-5mol/L Fe（Ⅲ）標準工作溶液）發(fā)光值厶和周圍孔發(fā)光值Ioi，如表l所示，周圍孔發(fā)光值的平均值與中心孔發(fā)光值之比的百分數(shù)即為化學(xué)發(fā)光分析儀的交叉污染。由實驗數(shù)據(jù)可以看出，中心孔的發(fā)光對周圍孔發(fā)光影響很小，儀器的交叉污染僅為0.02%，與儀器的出廠指標無明顯差異；同時證明了我們建立的化學(xué)發(fā)光標準反應(yīng)體系可以用來評價儀器的交叉污染的計量特性。

2.3.3 線性相關(guān)系數(shù)

采用化學(xué)發(fā)光標準體系對0，lxl0^-6，3xl0^-6，lxl0^-5，3xlO^-5，lxlO^-4mol/L Fe（Ⅲ）標準工作溶液進行測量，考察儀器測量線性相關(guān)系數(shù)，以檢測發(fā)光值信號減去本底信號得到的相對發(fā)光值△I為縱坐標（本底信號為Fe（Ⅲ）摩爾濃度為0時的發(fā)光值），F(xiàn)e（Ⅲ）的摩爾濃度為橫坐標繪制標準曲線，如圖4所示，F(xiàn)e（Ⅲ）在lxlO^-6～lx10^-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系：△I=2xIO¹⁰C-22396，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9986。

使用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒對0，lxl0^-11，1×10^-10.lxl0^-9，lx10^-8，lxl0^-7mol/L ATP標準工作溶液進行分析，考察儀器測量線性相關(guān)系數(shù)，以相對發(fā)光值△I（△I為檢測發(fā)光值信號減去本底信號，本底信號為ATP濃度為0時的發(fā)光值）為縱坐標，ATP的摩爾濃度為橫坐標繪制標準曲線，如圖5所示。AIP在l×10^-11～1x10^-7mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系：△I=7x10¹²C+550，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

從圖4和圖5可以看出，采用化學(xué)發(fā)光標準反應(yīng)體系和生物發(fā)光標準反應(yīng)反應(yīng)體系評價儀器的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9986和0.9999，說明儀器的線性相關(guān)系數(shù)的性能指標較好；這兩種反應(yīng)體系均能評價儀器的線性相關(guān)系數(shù)的計量特性。

2.3.4 靈敏度

使用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒對空門溶液的本底信號進行測量，平行檢測11次，本底信號相對發(fā)光強度分別為29，34，32，34，40，47，37，42，34，39，32，計算檢出限（3xS/N）為2.24xl0^-16mol ATP（100μL樣品體積），即為化學(xué)發(fā)光分析儀的靈敏度，達到儀器的出廠指標，說明ATP生物發(fā)光標準反應(yīng)體系可以用來評價儀器的靈敏度的計量特性，統(tǒng)一了化學(xué)發(fā)光分析儀靈敏度的表示方法。

3 結(jié)束語

本文模擬化學(xué)發(fā)光分析儀的實際工作狀態(tài)，建立了可溯源的魯米諾一過氧化氫一鐵（Ⅲ）-8-羥基喹啉化學(xué)發(fā)光標準體系和ATP-熒光素-熒光素酶生物發(fā)光標準體系，并將這兩種標準體系聯(lián)合，應(yīng)用到化學(xué)發(fā)光分析儀的計量校準工作中，對儀器測量重復(fù)性、交叉污染、線性相關(guān)系數(shù)和靈敏度計量特性進行實驗研究，實現(xiàn)了對化學(xué)發(fā)光分析儀計量性能的全面考察，為化學(xué)發(fā)光分析儀日常的校準工作以及國家計量校準規(guī)范的制訂提供了實驗基礎(chǔ)。