摘要：該文主要介紹近年來關(guān)于石墨烯及其衍生物在抗菌性方面的應(yīng)用研究進(jìn)展，包括石墨烯及其衍生物的抗菌性，抗菌性的測定方法對比，以及生物安全性評估等內(nèi)容。研究表明：石墨烯及其衍生物具有良好的抗菌性和生物相容性，同時也是抗菌活性物質(zhì)的理想載體。通過劑量調(diào)控和化學(xué)修飾可以保持石墨烯的優(yōu)越性，同時又避免其誘發(fā)生物毒性，拓寬其在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的研究與應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：石墨烯；氧化石墨烯；抗菌性

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-5124（2015）03-0008-06

0 引言

利用抗菌劑來抑制和殺滅有害細(xì)菌是提高人類健康水平的一個重要方法，傳統(tǒng)的抗菌劑，如抗生素、季銨鹽等不但會導(dǎo)致微生物的抗藥性，還會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。2010年，中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理所黃慶課題組首次發(fā)現(xiàn)了石墨烯材料的抗菌作用，即氧化石墨烯可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外流并殺死細(xì)菌。由于這是一種潛在的沒有耐藥性的物理“抗生素”，該工作發(fā)表后立即引起了科學(xué)界的廣泛興趣，之后，越來越多的研究證實了這點。但也有研究發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯可以提高細(xì)胞的生長能力，促進(jìn)細(xì)菌的生長。基于此，本文綜述了近年來關(guān)于石墨烯及其衍生物在抗菌性方面的研究進(jìn)展，主要包括石墨烯及其衍生物的抗菌性，抗菌性的測定方法對比，以及生物安全性評估等內(nèi)容，以期為石墨烯及其衍生物在抗菌材料方面的研究應(yīng)用提供參考。

1 石墨烯及其衍生物

2004年，英國曼徹斯特大學(xué)物理學(xué)家安德烈·海姆（andre geim）和康斯坦丁·諾沃肖洛夫（konscantinnovoselov）將石墨薄片的兩面粘在一種特殊的膠帶上，撕開膠帶把石墨片一分為二。不斷重復(fù)上述操作，薄片越來越薄，最后成功地得到了僅由一層碳原子構(gòu)成的薄片一石墨烯，并因此獲得2010年的諾貝爾物理學(xué)獎。石墨烯是由碳原子以sp'雜化連接的單原子層構(gòu)成的新型二維原子晶體，其基本結(jié)構(gòu)單元為有機(jī)材料中最穩(wěn)定的苯六元環(huán)，它可以被看做是構(gòu)成零維的富勒烯、一維的碳納米管及三維的石墨和金剛石的基本結(jié)構(gòu)單元（圖1）。單層石墨烯的厚度僅為0.35nm，是世界上已知最薄的二維材料，具有豐富而奇特的物理化學(xué)特性，如石墨烯的比表面積高、導(dǎo)熱性和力學(xué)性能突出、電子傳遞性能非凡，并具有一定的抗菌活性，可應(yīng)用在電子、信息、能源、物理學(xué)、生物醫(yī)藥和材料學(xué)等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，由于石墨烯化學(xué)穩(wěn)定性高，結(jié)構(gòu)完整，較難與其他介質(zhì)發(fā)生相互作用，并且其片層之間的范德華力較強(qiáng)，所以石墨烯不能分散于水和常見的有機(jī)溶劑中，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用。因此，人們主要通過物理或者化學(xué)方法對石墨烯進(jìn)行改性，提高其溶液分散性。氧化石墨烯（graphene ox-ide，GO）就是石墨烯改性的代表衍生物之一。氧化石墨烯一般由石墨經(jīng)強(qiáng)酸氧化而得。主要有3種制備氧化石墨的方法：Brodie法、Staudenmaier法和Hum-mers法，其中Hummers法是目前最常用的一種。氧化石墨烯與石墨烯的結(jié)構(gòu)基本相同，只是在單層碳原子結(jié)構(gòu)的基面上連接有大量的含氧基團(tuán)（見圖2），平面上含有-OH和C-O-C，而在其片層邊緣含有C=O和COOH。與石墨烯相比，氧化石墨烯具有良好的潤濕性能和表面活性，而且能被小分子或者聚合物插層后剝離，在改善材料的熱學(xué)、電學(xué)、力學(xué)等綜合性能方面發(fā)揮著非常重要的作用。與以往的碳基材料相比，氧化石墨烯具有以下特點：1）氧化石墨烯具有單原子層結(jié)構(gòu)，良好的親水性使其能夠在水中完全分散為單層，意味著它具有更大的比表面積和表面活性與其他介質(zhì)材料結(jié)合；2）修飾的氧化功能團(tuán)提高了氧化石墨烯的表面活性，它們能夠直接與介質(zhì)材料發(fā)生靜電吸附或鍵合作用，從而獲得穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)；3）氧化石墨烯具有類似于表面活性劑分子的自組裝能力，能夠在平整的固體表面自組裝形成具有多層結(jié)構(gòu)的連續(xù)的紙狀薄膜；4）氧化石墨烯的原子層骨架具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，可以起到機(jī)械支撐作用；5）與以往常采用的碳納米管相比，氧化石墨烯價格便宜、制備簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

2 石墨烯及氧化石墨烯的抗菌性

目前，石墨烯材料的抗菌性研究主要分為兩個方面。一方面是石墨烯和氧化石墨烯本身的抗菌活性研究。2010年，中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理所黃慶課題組首先報道了石墨烯在抗菌材料方面的研究。他們發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯懸液在與大腸桿菌孵育2h后抑制率達(dá)到90%以上，其抗菌性來源于氧化石墨烯對大腸桿菌細(xì)胞膜的機(jī)械切割破壞。另外，通過真空抽濾法將氧化石墨烯制備成肉眼可見的片狀石墨烯膜，也能有效地抑制大腸桿菌的生長。Zhao等采用輻射接枝的方法將氧化石墨烯連接到棉布上制備了氧化石墨烯基抗菌棉織物，并測定其抗菌性。研究結(jié)果表明氧化石墨烯基抗菌棉織物表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌性，抑菌率大于98%.且這種棉織物在被洗滌100次后抑菌率依然保持在90%以上。Akhavan等分別采用革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）對沉積在不銹鋼基質(zhì)上的氧化石墨烯納米墻（graphene oxide nanowalls）和石墨烯納米墻（graphene nanowalls）的抗菌性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯和石墨烯對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有良好的抗菌性能；石墨烯抗菌能力更強(qiáng)，可能是由于還原過程增加了石墨烯的銳度，增強(qiáng)了其與細(xì)菌之間的接觸切割作用。Liu等研究了氧化石墨烯和還原氧化石墨烯（rGO）對大腸桿菌活力的影響，發(fā)現(xiàn)GO的抗菌能力高于rGO，大尺寸的GO比小尺寸的GO擁有更好的抗菌性。同時，研究發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯和還原氧化石墨烯都可以氧化細(xì)菌體內(nèi)的還原型谷胱甘肽。因此認(rèn)為材料的抗菌性除了來自對細(xì)胞膜的破壞外，還可能來自材料引發(fā)的氧自由基進(jìn)而誘發(fā)的氧化損傷。其抗菌性可能存在以下3個環(huán)節(jié)：首先細(xì)菌黏附在材料上，然后石墨烯通過尖銳的邊角切割細(xì)胞膜，接著超氧離子介導(dǎo)氧化應(yīng)激最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Krishnamoorlhy等研究證實了石墨烯可以通過脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)行抗菌，間接說明了石墨烯的抗菌性可能與其氧化損傷相關(guān)。2013年Tu等提出了一種新的石墨烯抗菌機(jī)理，他們認(rèn)為，石墨烯不但可以通過接觸切割作用對細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)行破壞，還可以通過大規(guī)模的直接抽提細(xì)胞膜上的磷脂分子，來破壞細(xì)胞膜并殺死細(xì)菌。該研究將理論模擬和實驗結(jié)果相結(jié)合，計算機(jī)分子學(xué)模擬指出石墨烯獨特的二維結(jié)構(gòu)使其可以與細(xì)菌細(xì)胞膜上的磷脂分子發(fā)生超強(qiáng)的相互作用，導(dǎo)致大量磷脂分子脫離細(xì)胞膜并吸附到石墨烯的表面（見圖3）。透射電子顯微鏡實驗直接觀察到了細(xì)菌細(xì)胞膜與氧化石墨烯作用后產(chǎn)生的大范圍空腔結(jié)構(gòu)（見圖4），為理論計算結(jié)果提供了實驗證據(jù)。這種提取細(xì)胞膜脂類分子從而殺死細(xì)菌的分子機(jī)制很好地詮釋了石墨烯基納米材料的抗菌機(jī)理及細(xì)胞毒性原理。張歡對3種不同尺寸的氧化石墨烯（205.8，146.8，33.78nm）的抗菌性研究結(jié)果顯示，氧化石墨烯與細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生的這種脂類分子提取作用和GO的片層尺寸相關(guān)，尺寸越大，作用越強(qiáng)，抗菌性也越好。

石墨烯抗菌性研究的另一方面是氧化石墨烯負(fù)載銀的抗菌活性研究，以及氧化石墨烯與其他材料復(fù)合后的抗菌性研究。Zhu等采用靜電自組裝技術(shù)將納米銀顆粒負(fù)載到氧化石墨烯上制備出了GO-Ag復(fù)合材料，抗菌實驗結(jié)果表明，GO-Ag復(fù)合物對革蘭氏陰性菌一大腸桿菌的最小抑菌率（MIC）為3.2μg/mL，而納米銀顆粒對大腸桿菌的最小抑菌率為6.4μg/mL，同樣，GO-Ag復(fù)合物對革蘭氏陽性菌一枯草芽孢桿菌的最小抑菌率（MIC）為6.4μg/mL，而納米銀顆粒對枯草芽孢桿菌的最小抑菌率為9.6μg/mL，說明GO-Ag復(fù)合物具有更好的抗菌性。Liu等的研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)GO-Ag質(zhì)量濃度為80μg/mL時，GO-Ag復(fù)合物對大腸桿菌的抑菌率可達(dá)到99%，遠(yuǎn)高于同濃度時GO的抑菌率（10%）和納米銀的抑菌率（86%）。當(dāng)材料質(zhì)量濃度提高到100μg/mL時，GO的抑菌率（17%）和納米銀的抑菌率（96%）也不及GO-Ag復(fù)合物質(zhì)量濃度僅為80μg/mL時的抑菌率（99%）。類似的研究均發(fā)現(xiàn)納米GO-Ag；復(fù)合材料具有更好的抗菌性。此外，Lim等將GO、rGO分別與殼聚糖進(jìn)行復(fù)合后測定其復(fù)合物的抗菌性，結(jié)果表明GO或rGO與殼聚糖復(fù)合后并不影響其自身的抑菌作用，由于GO與殼聚糖有協(xié)同抗菌作用，使得復(fù)合物的抗菌能力優(yōu)于同濃度下GO或rGO的抑菌率。Santos等將聚乙烯咔唑連接到GO上形成新型復(fù)合物，其抗菌性研究結(jié)果也得出了類似的結(jié)論，這說明石墨烯材料在復(fù)合過程中依然保持了其抗菌特性，在涂料、包裝、抗菌織物和醫(yī)用材料中具有廣闊的應(yīng)用前景。專利CN10397595IA介紹了一種氧化石墨烯/銀絡(luò)合抗菌材料，該發(fā)明將銀與有機(jī)或無機(jī)絡(luò)合物結(jié)合形成小分子，再結(jié)合氧化石墨烯來增強(qiáng)其穩(wěn)定性，并通過緩釋性來延長抗菌性能，提高了氧化石墨烯銀系抗菌材料與其他助劑同浴時的穩(wěn)定性，還降低了銀系抗菌材料的成本，具有高效、無毒、環(huán)保的優(yōu)點。專利CN103651564A以氧化石墨烯溶液和青霉素陰離子捅層水滑石膠體溶液的混合液為原料，用溶液澆鑄法制備得到了氧化石墨烯/水滑石抗菌納米復(fù)合薄膜材料。將該納米復(fù)合薄膜暴露在新培養(yǎng)的溶壁微球菌溶液中24h后，薄膜表面幾乎沒有細(xì)菌附著，只有少量的細(xì)菌代謝產(chǎn)物，表明復(fù)合薄膜具有良好的抗菌性能。專利CN103191464A介紹了一種抗菌多孔氧化石墨烯/殼聚糖復(fù)合支架的制備方法。該方法以羧基化的氧化石墨烯為抗生素載體，利用氧化石墨烯表面的羧基與抗生素上的氨基發(fā)生靜電作用將抗生素吸附到氧化石墨烯上；再將抗菌金屬離子螯合在殼聚糖分子中，最后把載有抗生素的羧基化石墨烯和載有抗菌金屬的殼聚糖溶液混合，冷凍干燥，得到載有兩種不同抗菌材料的復(fù)合支架。該復(fù)合支架能在短期內(nèi)釋放抗生素以及長期釋放抗菌金屬離子，兼顧了短期抗菌與長期抗菌作用，抗菌效果好。

3 石墨烯抗菌性的測定方法比較

在微生物學(xué)中，抗菌劑的抗菌效果通常是通過檢測微生物在抗菌劑作用前后數(shù)目的變化來表示。常用的方法有平板菌落計數(shù)法、光電比濁度法、顯微鏡直接計數(shù)法、膜過濾法等。呂敏等采用光電比濁計數(shù)法、抑菌環(huán)法和平板菌落計數(shù)法對比測定了GO的抗菌效果。結(jié)果顯示抑菌環(huán)法和光電比濁計數(shù)法測定的GO無抗菌性，而平板菌落計數(shù)法測定的GO有明顯的抗菌性，抑菌率約80%。他們認(rèn)為抑菌環(huán)實驗法測定GO的抗菌性時，因GO不具有溶解性，其懸液滴加在濾紙上時GO不能擴(kuò)散，無法殺死濾紙邊緣的細(xì)菌而形成明顯的抑菌環(huán)；光電比濁法測定GO抗菌性時，由于其比表面積大，易吸附培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)形成易于細(xì)菌生長的附著點，促進(jìn)細(xì)菌的生長。因此，這兩種方法都不能準(zhǔn)確反映GO的抗菌效果；而采用平板菌落計數(shù)法測定GO抗菌性時，細(xì)菌與GO懸液充分接觸，作用后的細(xì)菌數(shù)目通過平板計數(shù)直接反映出來，避免了其他干擾因素，能夠客觀準(zhǔn)確地反映GO的抗菌效果。由此可見，使用不同的檢測方法，同一種抗菌劑也會得出不同的實驗結(jié)果。這就要求實驗人員在進(jìn)行抗菌性檢測的時候，要根據(jù)抗菌劑的性質(zhì)來進(jìn)行合理選擇。

4 石墨烯的生物安全評價

石墨烯及其衍生物在組織工程、藥物載體、生物檢測、生物成像等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，但其生物安全性評價的研究還比較缺乏。Zhang等采用示蹤技術(shù)研究了GO在小鼠體內(nèi)的分布和生物毒性，發(fā)現(xiàn)GO血液循環(huán)時間長，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吸收低。當(dāng)暴露在Img/kg GO下14d時，未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化；當(dāng)GO劑量提高到10mg/kg時，小鼠肺部會出現(xiàn)明顯的病理性改變，提示高劑量的GO存在肺毒性。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯對PC12細(xì)胞的代謝影響存在濃度依賴性，當(dāng)石墨烯質(zhì)量濃度低于0.01μg/mL時，細(xì)胞活性基本沒有降低，可以用在載藥、生物檢測和治療中。Wang等的研究也發(fā)現(xiàn)，GO對人成纖維細(xì)胞的毒性存在濃度依賴性。當(dāng)GO質(zhì)量濃度低于20μg/mL時，GO對細(xì)胞無明顯毒性，當(dāng)GO質(zhì)量濃度大于50μg/mL時出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率下降。Lu等也對GO的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)GO質(zhì)量濃度達(dá)到lOOmg/L時，細(xì)胞的相對存活率仍接近100%，說明GO細(xì)胞毒性較低。Kalbacova等研究了成骨細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞在石墨烯支架材料表面的細(xì)胞黏附及增殖能力，結(jié)果表明，石墨烯能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞黏附及增殖，提示石墨烯片無細(xì)胞毒性，有望成為具有骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)作用的骨移植物質(zhì)。Zhang等的研究發(fā)現(xiàn)，同等質(zhì)量濃度下，GO尺寸越小，其細(xì)胞毒性越小。Chang等的研究發(fā)現(xiàn)，3種不同尺寸G0（588，556，148nm）在質(zhì)量濃度小于50μg/mL時，無明顯的細(xì)胞毒性，但GO存在細(xì)胞氧化應(yīng)激作用，高濃度可使細(xì)胞活性稍微降低。上述研究說明石墨烯對細(xì)胞活性的影響存在一定的濃度依賴性，并且隨GO尺寸的減小細(xì)胞毒性隨之降低。

Zhang等在氧化石墨烯的生物毒性、可控聯(lián)合載藥和靶向運(yùn)輸?shù)确矫孢M(jìn)行了研究，結(jié)果表明，納米GO可被細(xì)胞吸收但沒有明顯的細(xì)胞毒性，對一些芳香類的小分子藥物具有超強(qiáng)的吸附能力，非常適合作為靶向藥物載體，葉酸修飾的GO在質(zhì)量濃度高達(dá)100μg/mL仍沒有明顯的細(xì)胞毒性。Yang等將聚乙二醇（PEG）修飾的GO注射到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)GO主要沉積在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，在肺內(nèi)未見到明顯的炎癥反應(yīng)，并且納米GO可以逐漸通過肝臟代謝。Ruiz等考察了胺基化的石墨烯對血小板活力的影響，結(jié)果顯示胺基化的石墨烯不會引起血小板聚合，并且小鼠靜脈注射后不會引起肺血栓栓塞。這說明石墨烯通過功能化修飾后可以降低其誘發(fā)的生物毒性，進(jìn)而發(fā)揮石墨烯的抗菌性和生物相容性，具有更安全的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

5 結(jié)束語

本文總結(jié)了近年來關(guān)于石墨烯及其衍生物在抗菌性及生物安全性方面的研究報道，研究表明，石墨烯與細(xì)菌作用時表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能，與細(xì)胞或生物體作用時只表現(xiàn)出微弱的細(xì)胞毒性，說明石墨烯是一種既具有抗菌性又具有良好生物相容性的納米材料，在生物醫(yī)學(xué)方面具有極大的應(yīng)用潛力。石墨烯同時還是抗菌活性物質(zhì)的理想載體，在開發(fā)新型抗菌材料方面有巨大潛力，但目前還只是針對石墨烯及其衍生物本身的抗菌活性和其他一些應(yīng)用進(jìn)行了初步研究。石墨烯的生物安全性研究雖然已經(jīng)積累了一定的研究基礎(chǔ)，但其生物效應(yīng)和安全性數(shù)據(jù)目前還不是很充分，需要綜合多方面的因素進(jìn)行深入研究。此外，石墨烯與生物體相互作用的機(jī)制研究尚處于初級階段，還有待進(jìn)一步地深入研究。當(dāng)然，石墨烯材料對生物體存在的潛在危害并不是絕對的，可以通過化學(xué)修飾和劑量調(diào)控保持石墨烯的優(yōu)越性又避免其誘發(fā)生物毒性，使其更為安全、廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域，隨著研究的不斷深入，石墨烯材料將極大地造福于人類。