賀 偉，劉永樂*，王發(fā)祥

響應(yīng)面法優(yōu)化蓮子磨皮粉中蛋白質(zhì)的提取工藝

賀 偉，劉永樂*，王發(fā)祥

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410 114）

磨皮粉是紅蓮子加工時機(jī)械磨皮的副產(chǎn)物，不僅產(chǎn)量很大，而且營養(yǎng)成分豐富，若不綜合利用會導(dǎo)致嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。通過Plackett-Burman試驗→最陡爬坡試驗→響應(yīng)面試驗的模式設(shè)計方法，考察溫度、時間等因素對磨皮粉蛋白質(zhì)提取率的影響，獲得磨皮粉蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)條件是Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03 mol/L、液固比17.5∶1（mL/g）、pH 10.5、提取溫度20 ℃、提取時間1 h、攪拌間隔時間10 min、超聲時間7.5 min，此時蛋白質(zhì)提取率達(dá)93.38%。

蓮子；蓮子磨皮粉；蛋白質(zhì)；響應(yīng)面法

蓮子是我國特有的種質(zhì)資源，屬睡蓮科多年水生草本植物蓮的成熟種子。我國蓮子種植面積150多萬畝，主要集中在湖南、湖北、江蘇、浙江、江西、福建等地區(qū)省市[1-5]。蓮子自古以來就是我國及東亞、東南亞人民所喜愛的珍貴營品，其味道清香，營養(yǎng)豐富，滋補(bǔ)療效顯著，而且蛋白質(zhì)、維生素、糖及鈣、磷等多種人體必需的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)含量也較高[6-12]。因此，蓮子相關(guān)產(chǎn)品深受消費(fèi)者喜愛，市場前景廣闊，蓮子的加工率和加工水平也在逐年提高。

在干蓮子加工過程中，為避免相關(guān)產(chǎn)品的外觀和口感受到影響，常常需要經(jīng)過機(jī)械處理去掉蓮子表面棕紅色的種皮，機(jī)械磨皮過程會產(chǎn)生約占蓮子總質(zhì)量1/5的蓮子磨皮粉，其不僅產(chǎn)量巨大，而且營養(yǎng)豐富，其中蛋白質(zhì)含量為18%～19%，淀粉含量更是高達(dá)40.00%。然而，在實際生產(chǎn)中，磨皮粉大多成了低值廢棄物，主要用于生產(chǎn)飼料甚至直接扔掉，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[13-14]。因此研究蓮子磨皮粉的高值化利用技術(shù)，對提高蓮子的綜合價值和保護(hù)環(huán)境都有著重要的實際意義。

近年來，蓮子磨皮粉的綜合利用開始受到關(guān)注，研究人員也開展了一些相關(guān)的研究，如陳軒等[15]對蓮子皮的化學(xué)成分進(jìn)行了初步分析，徐虹等[16-17]采用微波鹽提法優(yōu)化了蓮子皮蛋白質(zhì)提取工藝，但研究仍不夠深入。本研究創(chuàng)新采用Na2CO3-NaHCO3緩沖液[18]代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鹽或堿提取液，通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、響應(yīng)面試驗優(yōu)化磨皮粉蛋白質(zhì)提取條件，為將蓮子磨皮粉用于生產(chǎn)蓮子蛋白粉或其他含蓮蛋白食品及實現(xiàn)蓮子磨皮粉的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子磨皮粉由湖南粒粒珍湘蓮有限公司提供。

無水Na2CO3、NaHCO3、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、甲基紅、溴甲酚綠等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ATN-300全自動凱氏定氮儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；BL-620S島津電子天平 日本島津公司；LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓮子磨皮粉的制備

蓮子磨皮粉經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后過80 目篩，分裝，置于干燥器中備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量及提取率的測定

參考GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》[19]，測定磨皮粉中蛋白質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱取一定量的磨皮粉，在一定條件下提取蛋白質(zhì)后離心，將上液定容至100 mL，再取5 mL進(jìn)行消化，以凱氏定氮法測定提取液中的蛋白質(zhì)含量。按下式計算蛋白質(zhì)提取率。

1.3.3 提取液的篩選

分別以蒸餾水、0.5 mol/L NaCl溶液、0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 9.15）、0.2 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 7.0）對蓮子磨皮粉的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，選擇合適的提取液。

1.3.4 Plackett-Burman篩選顯著因子

根據(jù)經(jīng)驗及前期實驗摸索，選取Na2CO3-NaHCO3緩沖液作為蛋白質(zhì)提取劑，對緩沖液濃度、pH值、液固比、提取溫度、提取時間、超聲時間、攪拌間隔時間這7 個影響蛋白質(zhì)提取效果的因素進(jìn)行考察，以蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，根據(jù)試驗結(jié)果對因素進(jìn)行顯著性評價（P＜0.05），篩選出顯著性因子。試驗因素及水平見表1。

表 1 Plaekett-Burman試驗因素及水平Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.5 最陡爬坡試驗確定中心點

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選取Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度、液固比、pH值3 個顯著因素進(jìn)行最陡爬坡試驗，其他各因素則根據(jù)效應(yīng)系數(shù)正負(fù)選擇相應(yīng)的水平，從而快速地接近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.6 Box-Behnken試驗設(shè)計

以最陡爬坡試驗確定的提取率響應(yīng)值最大的條件為中心點，以Design-Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，試驗因素與水平見表2。

表 2 Box-Behnken試驗因素水平Table 2 Factors and levels used in Box-Benhnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取液選擇結(jié)果

表 3 不同提取液提取效果Table 3 Effect of different extract solvents on the extraction efficiency of protein

采用不同提取液對蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，結(jié)果如表3所示。根據(jù)提取率的結(jié)果可知，0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 9.15）對磨皮粉蛋白質(zhì)的提取率最高，以其為最佳提取液，進(jìn)行下一步實驗。

2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

表 4 Plaekett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Plackett-Burman design and experimental resultsTable 4 Plackett-Burman design and experimental results

Plackett-Burman法是一種近飽和的二水平試驗設(shè)計方法。它能用最少試驗次數(shù)估計出因素的主效應(yīng)，以便快速有效地從眾多考察因素中篩選出最為重要的幾個因素供進(jìn)行下一步研究[20-23]。采用N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計，結(jié)果如表4所示。

表 5 Plackett-Burman試驗結(jié)果的估計效應(yīng)和系數(shù)Table 5 Analysis of variance (AVONA) of Plackett-Burman experimental results

圖 1 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖（響應(yīng)為提取率，α=0.01，臨界值2.920）Fig.1 Pareto chart of the standardized effects (response for the extraction yield, α = 0.01)

用Minitab 16軟件對表4中的Plackett-Burman試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到各因素的方差分析結(jié)果（表5）以及標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖（圖1）。經(jīng)分析可知Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度、提取溫度、攪拌間隔時間對磨皮粉蛋白質(zhì)提取率顯示出負(fù)效應(yīng)，而pH值、液固比、提取時間、超聲時間顯示為正效應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖則顯示在90%的置信水平內(nèi)，液固比、Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度以及pH值的效應(yīng)最大，對提取率響應(yīng)值影響顯著。

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

最陡爬坡試驗是一種通過連續(xù)增加或減少顯著因素的試驗值以使響應(yīng)值快速逼近最佳值區(qū)域的程序，其爬坡的方向由各因素效應(yīng)系數(shù)的正負(fù)決定，變化步長則根據(jù)經(jīng)驗及相關(guān)效應(yīng)值的大小來確定。最陡爬坡試驗確定的顯著因素的變化幅度分別為Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.01 mol/L、pH 0.2、液固比2∶1，提取時間和攪拌間隔時間取Plackett-Burman試驗時的高水平，其余因素取值Plackett-Burman試驗時的低水平。分析最陡爬坡試驗結(jié)果（表6）可知：0＋3Δ號試驗組的提取率響應(yīng)值達(dá)93.30%，為最大值，之后響應(yīng)值開始下降。選取此試驗條件作為Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計的中心點。

表 6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Steepest ascent design and experimental results

2.4 Box-Behnken試驗結(jié)果

表 7 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Box-Behnken design and experimental resultsTable 7 Box-Behnken design and experimental results

表 8 Box-Behnken試驗結(jié)果方差分析Table 8 ANOVA of Box-Behnken experimental results

響應(yīng)面試驗的設(shè)計及結(jié)果分析見表7。利用Design-Expert 8.0.5b軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合[24-26]，編碼回歸方程Y=92.81＋0.73A-0.82B＋0.72C-0.062AB＋0.38AC-0.59BC-2.84A2-2.90B2-0.12C2，而實際因素的回歸方程為：蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率=-360.067 42＋16.437 50A＋33.196 25B＋29.292 19C-1.562 50AB＋46.875 00AC-0.737 50BC-7090.625 00A2-0.725 31B2-0.773 44C2，為了驗證模型的有效性，進(jìn)行了方差分析（表8）。如表8所示，A、B、A2、B2為顯著性影響因素，其他變量的影響均不顯著（P＞0.05）。該回歸模型的P值為0.005 4（小于0.01），即模型顯著擬合程度好。同時失擬項P值為0.313 4（大于0.05），即失擬項不顯著，說明該響應(yīng)面能夠較真實地反映試驗結(jié)果，有實際應(yīng)用意義，可用此模型對蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)的提取效果進(jìn)行分析預(yù)測。

圖 2 Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度和液固比對提取率的影響Fig.2 Effect of Na2CO3-NaHCO3concentration and solvent-to-solid ratio on the extraction efficiency of protein

圖 3 Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度和pH值對提取率的影響Fig.3 Effect of Na2CO3-NaHCO3concentration and pH on the extraction efficiency of protein

圖 4 液固比和pH值對提取率的影響Fig.4 Effect of solvent-to-solid ratio and pH on the extraction efficiency of protein

從圖2 Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度與液固比的交互作用顯示，在液固比17∶1～18∶1、Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.02～0.04 mol/L范圍內(nèi)，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率響應(yīng)值可達(dá)最佳區(qū)域。且提取率隨著液固比及Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度的增加先升高后降低。圖3和圖4顯示蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率隨pH值的升高而增大，但是幅度不大。從以上3個圖可知提取液濃度和液固比對應(yīng)的曲面比較陡峭，說明這兩個因素相對結(jié)果影響顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。結(jié)合響應(yīng)面及等高線圖可知，蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率的最佳取值范圍位于Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.02～0.04 mol/L、液固比17∶1～18∶1、pH 10.1～10.5。為了進(jìn)一步確定變量的最佳取值點，通過Design-Expert 8.0.5b軟件的Optimization功能，計算得到蛋白質(zhì)提取率有最大響應(yīng)值時3 個因素的取值，即Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03mol/L、液固比17.51∶1、pH 10.5，該條件預(yù)測條件下的蓮子磨皮粉蛋白質(zhì)提取率為93.687 7%。

在修正后的最優(yōu)條件Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03 mol/L、液固比17.5∶1、pH 10.5、提取溫度20 ℃、提取時間1 h、攪拌間隔時間10 min、超聲時間7.5 min條件下進(jìn)行3 次驗證實驗，測得蛋白質(zhì)的提取率為93.38%，比預(yù)測值略低，說明用該回歸方程分析所獲得的優(yōu)化提取條件是可信的。

3 結(jié) 論

通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、響應(yīng)面試驗獲得磨皮粉蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)條件是Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03 mol/L、液固比17.5∶1、pH 10.5、提取溫度20 ℃、提取時間1 h、攪拌間隔時間10 min、超聲時間7.5 min，此時蛋白質(zhì)提取率可達(dá)93.38%。

[1] 鄭寶東. 蓮子科學(xué)與工程[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2010: 3-15.

[2] 鄭寶東, 鄭金貴, 曾紹校. 我國主要蓮子品種營養(yǎng)成分的分析[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2003(2): 153-156.

[3] DHARMANDA S. Lotus seed: food and medicine[R]. Portland, Oregon, USA, 2002.

[4] GARLAND S. The lotus seed[M]. UK: Harcourt Children’s Books, 1993: 10-18.

[5] SHEN-MILLER J, MUDGETT M B, WILLIAM S J, et al. Exception seed longevity and robust growth: ancient sacred lotus from China[J]. American Journal of Botany, 1995, 82(11): 1367-1380.

[6] 陸寧, 宛曉春, 鄭國社. 湘蓮乳飲料的加工技術(shù)[J]. 食品研究與開發(fā), 1998, 19(2): 26-27.

[7] SRIDHAR K R, BHAT R. Lotus-a potential nutraceutical source[J]. Journal of Agricultural Technology, 2007, 3(1): 143-155.

[8] 蔡聯(lián)輝, 曾虹燕, 王亞舉, 等. 蓮子蛋白質(zhì)的氨基酸組成及其營養(yǎng)評價[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2010, 32(5): 503-506.

[9] 張羽. 蓮子中蛋白質(zhì)的分離及其食品功能特性研究[D]. 南京: 南京師范大學(xué), 2008.

[10] ZENG Hongyan, CAI Lianhui, CAI Xiling, et al. Structure characterization of protein fractions from lotus (Nelumbo nucifera) seed[J]. Journal of Molecular Structure, 2011, 1001(1/2/3): 139-144.

[11] BHAT R, SRIDHAR K R. Nutritional quality evaluation of electron beam-irradiated lotus (Nelumbo nucifera) seeds[J]. Food Chemistry, 2008, 107(1): 174-184.

[12] YEN G C, DUH P D, SU H J. Scavenging effects of lotus seed extracts on reactive nitrogen species[J]. Food Chemistry, 2006, 94(4): 596-602.

[13] 張羽, 鄭鐵松, 陳靜. 蓮子蛋白質(zhì)提取工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(9): 144-146.

[14] 江志偉, 沈蓓英. 蛋白質(zhì)加工技術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出社, 2002: 126-132.

[15] 陳軒, 周堅. 蓮子皮化學(xué)成分的初步分析[J]. 食品工程, 2011(10): 139-141.

[16] 徐虹, 王馨儀, 曹楊, 等. 蓮子紅皮蛋白微波輔助鹽提工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué), 2011, 32(4): 87-91.

[17] 徐虹, 朱雨薇, 曹楊, 等. 蓮子紅皮多糖提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2011, 32(2): 266-268.

[18] 袁道強(qiáng), 黃建華. 生物化學(xué)實驗和技術(shù)[M]. 北京: 中國輕工出版社, 2006: 298-299.

[19] 衛(wèi)生部. GB/T 5009.5—2003 食品中蛋白質(zhì)的測定[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[20] DAVIES O L, GEORGE E P, LEWIS R C. The design and analysis of Industrial experiments[M]. London: Longman Group Limited, 1978: 45-48.

[21] MONTGOMERY D C. Design and analysis of experiments[M]. New York: John Wiley and Sons, 1991: 35-40.

[22] 劉永樂, 王發(fā)祥, 俞健, 等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化蓮子蛋白質(zhì)的提取條件[J].長沙理工大學(xué)學(xué)報, 2012, 9(4): 1-4.

[23] GUZUN A S, STROESCU M, JINGA S I. Plackett-Burman experimental design for bacterial cellulose-silica composites synthesis[J]. Science and Engineering, 2014, 42: 280-288.

[24] 王靈昭, 鄧家權(quán). 微波法提取雨生紅球藻中蝦青素的工藝研究[J].食品研究與開發(fā), 2007, 28(12): 96-100.

[25] 楊文雄, 高彥祥. 響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國食品添加劑, 2005(2): 68-71.

[26] 王滿生, 劉永樂, 王發(fā)祥, 等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化草魚肉冷殺菌工藝[J].食品科學(xué), 2011, 32(20): 48-51.

Optimization of Extraction Process for Peel Waste Protein from Lotus Seeds by Response Surface Methodology

HE Wei, LIU Yongle*, WANG Faxiang
(College of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

A large amount of red lotus peel waste, which contains abundant nutrients, is produced during mechanical peeling of red lotus seeds. Accordingly, insufficient utilization of this byproduct is a serious waste of resource. The present study examined the impact of various factors on the extraction efficiency of protein from lotus seed peel waste by the combined use of Plackett-Burman design, steepest ascent design and response surface methodology. We found that 0.03 mol/L Na2CO3-NaHCO3buffer solution at pH 10.5 was the best solvent for the extraction of lotus seed peel waste protein. A solvent-to-solid ratio of 17.5:1, an extraction temperature of 20 ℃ and 1 h extraction proved optimal, resulting in an extraction yield of 93.38%.

lotus seed； peel waste； protein； response surface analysis

TS201.6；TS207.4

A

1002-6630（2015）08-0024-05

10.7506/spkx1002-6630-201508005

2014-09-26

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B08）

賀偉（1989—），女，碩士研究生，研究方向為大宗農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：583346178@qq.com

*通信作者：劉永樂（1962—），男，教授，博士，研究方向為大宗農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：1y1e19@163.com