宣寧，趙傳志，彭振英，陳高，邊斐，廉明政，劉國(guó)霞，王興軍，畢玉平,2

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轉(zhuǎn)人工miRNA抗玉米粗縮病毒載體玉米的培育及其抗病能力

宣寧1，趙傳志1，彭振英1，陳高1，邊斐1，廉明政1，劉國(guó)霞1，王興軍1，畢玉平1,2

1 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100 2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生教育中心，山東 濟(jì)南 250100

宣寧, 趙傳志, 彭振英, 等. 轉(zhuǎn)人工miRNA抗玉米粗縮病毒載體玉米的培育及其抗病能力. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(9): 1375–1386.Xuan N, Zhao CZ, Peng ZY, et al.Development of transgenic maize with anti-rough dwarf virus artificial miRNA vector and their disease resistance. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1375–1386.

玉米是重要的糧食作物，水稻黑條矮縮病毒 (RBSDV) 是玉米粗縮病的病原，由其引起的玉米粗縮病給玉米生產(chǎn)造成重大損失。利用人工miRNA構(gòu)建抗病毒植物的技術(shù)已經(jīng)在多種植物中被證明有效，但是在玉米中的嘗試未見(jiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)根據(jù)玉米zea-miR159a的前體序列和RBSDV基因組中編碼功能蛋白的基因和基因沉默抑制子的序列信息設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了用于沉默RBSDV編碼基因和基因沉默抑制子的amiRNA (Artificial miRNA) 基因。構(gòu)建pCAMBIA3301-121-amiRNA植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米自交系綜31 (Z31)。對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行分子檢測(cè)，選擇miRNA表達(dá)量高的純合體株系進(jìn)行自然發(fā)病實(shí)驗(yàn)，按0?4的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查玉米粗縮病的嚴(yán)重度。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)抗粗縮病毒人工miRNA載體玉米純合體株系的抗病表現(xiàn)好于野生型玉米，其中針對(duì)基因組6的S6-miR159轉(zhuǎn)基因玉米抗病情況較好。研究表明利用人工miRNA技術(shù)構(gòu)建抗病毒病玉米新品種是可行的。

amiRNA，玉米粗縮病毒，轉(zhuǎn)基因玉米

玉米是重要的糧食作物，是食品和飼料加工的重要原料。玉米病毒病害的發(fā)生和流行嚴(yán)重危害玉米生產(chǎn)，特別是玉米粗縮病，給玉米生產(chǎn)造成了很大的損失。

玉米粗縮病是由玉米粗縮病毒 (Maize rough dwarf virus，MRDV) 引起的，于1954年傳入我國(guó)[1]。研究證實(shí)，MRDV與引起水稻黑條矮縮病的病原-水稻黑條矮縮病毒 (Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV) 是同一種病毒[2-4]，該病毒除了侵染玉米和水稻，還能夠侵染高粱、大麥、小麥等其他禾本科糧食作物和雜草。RBSDV基因組由10條雙鏈RNA組成，按其在聚丙烯酰胺上遷移距離由小到大的順序依次命名為：S1–S10[5]。其中，RBSDV的S1–S6分別編碼病毒的一個(gè)重要蛋白，其中S1可能編碼RNA依賴的RNA聚合酶；S2長(zhǎng)約3 813 nt，編碼一個(gè)有1 226個(gè)氨基酸組成的蛋白，推測(cè)可能是核心結(jié)構(gòu)蛋白；S6長(zhǎng)2 645 nt，雖然功能未知，但利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析表明，其編碼蛋白存在高度保守的親水性結(jié)構(gòu)域及多個(gè)跨膜區(qū)域，可能具有結(jié)合RNA及ATPase活性，表明RBSDV的S6基因可能具有編碼植物基因沉默抑制子的功能；S8全序列約為1 936 bp，只含有1個(gè)ORF，編碼蛋白的分子量約為68 kDa，可能是病毒的核心衣殼蛋白[6-7]。

MicroRNA (miRNA) 是真核生物中廣泛存在的一類具有調(diào)節(jié)功能的小分子RNA，這些小RNA能夠識(shí)別特定的靶mRNA，通過(guò)降解或抑制翻譯負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。人工miRNA (Artifical miRNA，amiRNA) 技術(shù)是利用內(nèi)源miRNA前體骨架 (Pre-miRNA)，通過(guò)替換pre-miRNA序列中的成熟片段 (miRNA/miRNA*)，產(chǎn)生具有新功能的miRNA[8]。利用MicroRNA的方法構(gòu)建抗病毒植物已經(jīng)被證明是有效的，其在抗病育種方面的潛力逐漸被人們認(rèn)識(shí)。Schwab等利用擬南芥pre-miRNA172和pre-miRNA319作骨架，將miRNA/miRNA*區(qū)替換成與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)的片段，形成了amiRNA，在擬南芥中超表達(dá)后引起表型的明顯改變[9]，證明amiRNA可以有效沉默單個(gè)和多個(gè)靶基因；Warthmann等利用水稻osa-MIR528作骨架構(gòu)建了人工miRNA，成功對(duì)水稻靶基因高效干涉[10]。Niu等通過(guò)修飾擬南芥miR159的前體獲得了能夠分別針對(duì)P69和HC-Pro的amiR- P69159和amiR-HC-Pro159，表達(dá)amiR-P69159和amiR-HC-Pro159的轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠分別特異抵抗TYMV和TuMV病毒感染[11]。Qu等設(shè)計(jì)了針對(duì)黃瓜花葉病毒 (CMV) 的沉默抑制子2b的amiRNA并在煙草中表達(dá)，獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因煙草植株，并且轉(zhuǎn)基因煙草的抗性水平和miRNA的表達(dá)水平成正相關(guān)[12]。這些結(jié)果均表明amiRNA 技術(shù)在植物中是可以廣泛應(yīng)用的。

本文基于玉米粗縮病病毒序列，選擇其關(guān)鍵蛋白和基因沉默抑制子的保守序列構(gòu)建amiRNA載體，轉(zhuǎn)化玉米優(yōu)良自交系，分析轉(zhuǎn)基因植物后代的amiRNA表達(dá)水平及自然發(fā)病情況，推測(cè)利用amiRNA構(gòu)建抗病毒病玉米新品種的可行性。

1 材料與方法

1.1 amiRNA載體的構(gòu)建

選擇在玉米里表達(dá)量較高的miR159的pre-miRNA作為骨架，在WMD3 (Web MicroRNA Designer，http://wmd31weigelworld1org/cgi2bin/ webapp1cgi) 系統(tǒng)中設(shè)計(jì)amiRNA的成熟體序列 (表1)。使用WMD3的“Designer”工具，首先輸入RBSDV的基因組序列，找出能夠沉默RBSDV的候選amiRNA成熟體序列，再選擇玉米的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入候選amiRNA成熟體序列，在線提交，通過(guò)和玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確保amiRNA成熟體不會(huì)沉默玉米的內(nèi)源基因，并根據(jù)amiRNA 的相關(guān)參數(shù)(如m值等) 選擇amiRNA。設(shè)計(jì)正反向PCR引物并在引物端分別添加Ⅰ和HⅠ酶切位點(diǎn) (表2)，通過(guò)PCR，得到帶有酶切位點(diǎn)的特異miRNA序列，通過(guò)酶切連接裝載到植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-121上，成為amiRNA表達(dá)載體。

1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的amiRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105。在玉米自交系Z31自交授粉10?12 d后，剝?nèi)∮衩子着?，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。23 ℃共培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)入28 ℃培養(yǎng)室恢復(fù)培養(yǎng)?；謴?fù)培養(yǎng)后，第1輪采用5 mg/L終濃度的除草劑PPT進(jìn)行篩選，以后3輪以終濃度為10 mg/L的PPT進(jìn)行篩選。每2周為1輪篩選，前后共篩選4輪。將篩選獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)胚狀體的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，3周后可以出現(xiàn)胚狀體。再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，培養(yǎng)條件為28 ℃，每日3 000 Lx光強(qiáng)，光照16 h，很快就會(huì)有再生小苗出現(xiàn)。再生的小植株長(zhǎng)到3片葉時(shí)，可將幼苗移植到玻璃瓶中，并在室內(nèi)培養(yǎng)。待小苗長(zhǎng)出新葉及根后，將幼苗從玻璃瓶中取出，自來(lái)水沖凈培養(yǎng)基，移栽于混有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石 (1∶3) 的小花盆中。當(dāng)玉米又長(zhǎng)出2?3片新葉時(shí)，可將其移入溫室中進(jìn)行正常生長(zhǎng)。

表1 AmiRNA載體功能序列

Sense sequences were expressed in italics underlined, antisense sequences were expressed in italics underlined double.

表2 AmiRNA引物序列

The sequences in underlined means restriction enzyme sites.

1.3 PCR檢測(cè)

幼苗取葉片用CTAB提取法提取DNA，miRNA載體質(zhì)粒和野生型玉米分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照用Bar primer (表3) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。PCR檢測(cè)結(jié)果在1%瓊脂糖凝膠上觀察。

表3 引物序列

1.4 Basta涂抹檢測(cè)

將Basta原藥 (Phosphinothricin，PPT含量18%) 稀釋為3‰溶液。用毛筆涂抹或噴灑在玉米葉片上，2?3 d后觀察，出現(xiàn)黃褐色枯斑的植株表示對(duì)Basta敏感，仍保持原來(lái)綠色的為抗性株。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)

純合體的苗子取樣按照Trizol試劑 (Invitrogen，USA) 說(shuō)明書的方法提取總RNA。總RNA (5 μg) 用RQI DNA酶 (Promega) 處理去除DNA殘留。第一鏈cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega) 合成。實(shí)時(shí)定量熒光PCR (RT-qPCR) 使用ABI 7300棱鏡HT序列檢測(cè)系統(tǒng) (Applied biosystems) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。玉米α-Tubulin基因 (檢索號(hào)AY103544.2) 作為內(nèi)參 (Tubulin primer，表3) 來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化模板cDNA。根據(jù)玉米內(nèi)源miRNA159的莖環(huán)序列設(shè)計(jì)引物 (miRNA159 primer，表3)。每個(gè)PCR重復(fù)3次。PCR體系為20 μL，含有1×SYBR綠色熒光染料混合物 (TaKaRa)、200 nmol/L引物、1 μL 1∶10稀釋的模板cDNA。PCR程序如下：預(yù)變性95 ℃ 5 min，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 31 s，熔解曲線95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由ABI7300軟件 (Applied biosystems) 分析。miRNA相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct方法[13]計(jì)算，野生型玉米中表達(dá)量作為1，誤差線表示(=3)。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定

每個(gè)amiRNA載體選擇4個(gè)獨(dú)立的amiRNA 表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因玉米T2代純合體株系進(jìn)行粗縮病毒自然發(fā)病實(shí)驗(yàn)。每個(gè)單獨(dú)的株系種植100株。實(shí)驗(yàn)在山東濟(jì)南飲馬泉實(shí)驗(yàn)基地邊緣土地進(jìn)行，轉(zhuǎn)基因玉米田間種植在轉(zhuǎn)基因隔離區(qū)進(jìn)行，周圍密集種植6行野生型玉米作為保護(hù)行。該試驗(yàn)地一年兩熟，夏玉米和冬小麥輪作，試驗(yàn)田周圍雜草叢生，保證了越冬和越夏的毒源。播期在5月中旬。株行距30 cm×60 cm。轉(zhuǎn)基因玉米與野生型玉米隔行種植。田間水肥、中耕管理和病蟲害防治同大田。玉米生長(zhǎng)后期，按0?4級(jí)的如下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[14]調(diào)查玉米粗縮病的嚴(yán)重度，掛牌標(biāo)記調(diào)查株的病級(jí)。

玉米粗縮病嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：健株；1級(jí)：株高為健株株高的4/5左右，僅上部幾個(gè)葉片葉背面有白色蠟淚狀突起；2級(jí)：株高為健株株高的2/3左右，整株顯癥；3級(jí)：株高為健株株高的1/2左右，整株顯癥；4級(jí)：株高為健株株高的1/3以下，整株顯癥或提早枯死。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米粗縮病毒序列收集和關(guān)鍵基因鑒定

2010年收集山東省濟(jì)南、濟(jì)寧和德州的玉米粗縮病植株，提取病毒RNA，利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI中公布的RBSDV基因組的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得了這些地區(qū)RBSDV的S1、S2、S6和S8基因的序列，測(cè)序結(jié)果確認(rèn)了引起這些地區(qū)玉米粗縮病的病原菌為RBSDV。將S1、S2、S6和S8的序列信息提交到在線軟件WMD3，設(shè)計(jì)了能夠沉默S1、S2、S6和S8基因的amiRNA成熟體序列及其星號(hào)序列。

根據(jù)玉米zea-miR159a的前體序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了包含amiRNA成熟體序列的正向引物和包含人工miRNA成熟體星號(hào)序列的反向引物。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了amiRNA前體序列。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與PCR檢測(cè)

將amiRNA前體序列構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入玉米幼胚，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)-恢復(fù)-4輪篩選-恢復(fù)-誘導(dǎo)-分化-生根-成苗等階段后得到玉米擬轉(zhuǎn)化株 (圖1)。

T0代幼苗取葉片提DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，提取DNA后，通過(guò)Bar基因擴(kuò)增確定是否有目的基因的插入。陽(yáng)性植株是能擴(kuò)增出與篩選基因Bar同樣大小的條帶 (370 bp)，而未轉(zhuǎn)化植株沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)的片段。部分植株的PCR結(jié)果如圖2所示。

每個(gè)載體我們轉(zhuǎn)化了大約3 000?5 000個(gè)玉米幼胚，經(jīng)過(guò)4 輪篩選S1收到了11個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，S2收到了10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，S6收到了26個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，S8收到了15個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。

2.3 Basta涂抹檢測(cè)

T1代轉(zhuǎn)基因玉米長(zhǎng)至5?7葉期時(shí)進(jìn)行Basta涂抹檢測(cè)，選擇Basta抗性株與非抗性株 (圖3)3∶1分離的株系繁殖T2代種子。

T2代轉(zhuǎn)基因玉米長(zhǎng)至5?7葉期時(shí)同樣進(jìn)行Basta涂抹檢測(cè)，若同一株系的苗子全部對(duì)Basta有抗性，即保持原來(lái)綠色的即為純合株系。選擇純合株系進(jìn)行后續(xù)的分子檢測(cè)和表型鑒定。

圖1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化

圖2 T0代轉(zhuǎn)基因苗PCR分子檢測(cè)

圖3 涂抹Basta表型示意圖

2.4 轉(zhuǎn)基因植株amiRNA表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

Basta篩選鑒定純合體的苗子混合取樣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，由于miRNA前體的表達(dá)模式與成熟miRNA的表達(dá)模式一致[20]，根據(jù)構(gòu)建載體使用的玉米內(nèi)源miRNA159的莖環(huán)序列設(shè)計(jì)引物，用Real-time PCR的方法鑒定pre-miRNA表達(dá)量，借此反映成熟miRNA的表達(dá)量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米中外源amiRNA有所表達(dá)，但表達(dá)程度不一致 (圖4)。部分轉(zhuǎn)基因玉米amiRNA表達(dá)量下降，可能由于轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象所致。

2.5 轉(zhuǎn)miRNA載體玉米的表型鑒定

玉米粗縮病發(fā)病規(guī)律為苗齡越小，發(fā)病越重。芽鞘期至2葉1心期感病多為絕產(chǎn)株。8葉期以后感病的植株病情顯著減輕。11葉以后基本無(wú)癥狀，極少數(shù)顯癥株也均為1級(jí)輕病株。

根據(jù)山東省往年玉米粗縮病發(fā)病情況，選擇5月14號(hào)播種，野生型玉米與人工miRNA載體轉(zhuǎn)基因玉米隔行播種，7月下旬觀察人工miRNA載體轉(zhuǎn)基因玉米與野生型玉米生長(zhǎng)情況，按照按0?4級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查玉米粗縮病的嚴(yán)重度，掛牌標(biāo)記調(diào)查株的病級(jí)。調(diào)查結(jié)果顯示 (圖5–6)，野生型玉米無(wú)健株，100%發(fā)病，且4級(jí)重度感染株比例較高，占37.5%，轉(zhuǎn)基因玉米抗病表現(xiàn)好于野生型玉米，幾乎沒(méi)有4級(jí)重度感染株。其中S6-miR159載體轉(zhuǎn)基因玉米健株 (0級(jí)) 和輕微感病株 (1級(jí)) 比例達(dá)到41.5%，為4個(gè)載體轉(zhuǎn)基因玉米中最高，抗病情況最好。轉(zhuǎn)基因玉米植株也存在一定比例的2級(jí)和3級(jí)感病株，可能是轉(zhuǎn)基因玉米單株之間存在miRNA表達(dá)量差異，miRNA表達(dá)量較少，干擾能力弱導(dǎo)致。

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，玉米粗縮病的防治措施主要以農(nóng)業(yè)防治，例如調(diào)整播期、清除雜草、及時(shí)拔除田間病株等措施，和關(guān)鍵期的藥劑處理為主，然而，這些措施不但限制了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，并且化學(xué)農(nóng)藥種類的增多與濫用又使食用農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留與環(huán)境污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重。由于缺少優(yōu)良的抗病自交系，利用傳統(tǒng)的雜交育種培養(yǎng)抗玉米粗縮病品種面臨著巨大的挑戰(zhàn)。相比傳統(tǒng)雜交育種，利用基因工程技術(shù)手段培育抗病品種是徹底解決玉米粗縮病的根本途徑。

圖4 部分T2代轉(zhuǎn)基因苗miRNA表達(dá)量檢測(cè)

圖5 轉(zhuǎn)基因玉米抗粗縮病病株級(jí)別統(tǒng)計(jì)

圖6 轉(zhuǎn)基因玉米抗粗縮病表型鑒定

隨著病毒基因組研究的深入，病毒基因工程成為了培養(yǎng)抗病品種的工具，目前利用基因工程改良作物抗病性的手段主要有3種：1) 將植物病毒的衣殼蛋白基因 (Coat protein，CP)、復(fù)制酶基因、核酶基因等構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，通過(guò)表達(dá)病毒衣殼蛋白、復(fù)制酶基因和核酶基因等而使轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生對(duì)多種病毒的抗性；2) 利用RNA干擾 (RNA interference，RNAi)的原理，設(shè)計(jì)病毒基因的反向重復(fù)序列，構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到對(duì)病毒免疫的轉(zhuǎn)基因植株[15]；3) 通過(guò)修飾植物microRNA的前體，構(gòu)建針對(duì)目標(biāo)病毒的功能基因或者基因沉默抑制子基因的編碼序列的人工miRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物并獲得具有抗病毒能力的轉(zhuǎn)基因植株。目前，前2種策略研究比較深入，但這2種方法也各有其弊端：病毒RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物的抗病性和外源基因插入的拷貝數(shù)有密切的聯(lián)系，轉(zhuǎn)基因后代的安全性、抗病穩(wěn)定性、抗性水平和遺傳性也備受質(zhì)疑；利用PTGS (RNAi) 介導(dǎo)的植物抗性具有抗病性強(qiáng)、抗性持久、生物安全性高等特點(diǎn)。但是許多病毒能夠編碼抑制蛋白，抑制宿主的RNA干擾機(jī)制，此外還會(huì)產(chǎn)生一系列序列信息不明確的siRNAs，這種不確定性大大降低了RNA沉默的精確度。另一方面，可能產(chǎn)生次級(jí)的siRNAs，造成非目標(biāo)基因的沉默，使結(jié)果變得復(fù)雜[16-20]。這3種方法的原理都是通過(guò)病毒基因的沉默，達(dá)到植物的范疇。但是，人工miRNA方法的原理是miRNA介導(dǎo)的基因沉默途徑，由于引入植物體的外源基因片段只有21 bp左右，引起植物內(nèi)源基因沉默的幾率大大降低，而且這21 bp的序列是已知的，通過(guò)全基因組比對(duì)可以對(duì)21 bp的成熟體序列作出較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。第1種和第2種方法的原理都是RNAi介導(dǎo)的基因沉默途徑，互補(bǔ)的雙鏈RNA在植物體內(nèi)被加工成一系列22 nt左右的RNA片段，這一系列22 nt的雙鏈RNA片段和植物內(nèi)源基因互補(bǔ)配對(duì)的幾率增加，更容易造成植物內(nèi)源基因的沉默。

本研究獲得的人工miRNA抗粗縮病轉(zhuǎn)基因玉米株系，對(duì)玉米粗縮病毒有顯著抗性，其中S6-miR159載體抗性較顯著。因此人工miRNA載體轉(zhuǎn)化玉米，可以對(duì)粗縮病毒起到較好的干擾作用。

本文中人工miRNA載體的構(gòu)建，采用玉米自身的miRNA前體作為骨架，和傳統(tǒng)的通過(guò)引入外源基因改良作物品質(zhì)有很大不同，一定程度上可以減少引入外源基因造成的不確定表型，也可以避免轉(zhuǎn)基因的爭(zhēng)議。相比PTGS (RNAi) 介導(dǎo)的基因沉默，人工miRNA在培養(yǎng)抗病毒植物上具有其獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：1) RNAi介導(dǎo)的基因沉默依賴DCL4途徑，而病毒編碼的抑制蛋白 (基因沉默抑制子) 可以抑制這種沉默，能夠抑制RNAi機(jī)制的發(fā)生。人工miRNA通過(guò)DCL1途徑，可以避開(kāi)一些病毒抑制蛋白的拮抗作用；2) RNAi介導(dǎo)的基因沉默在植物中轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)片段病毒基因組，這些病毒基因組序列可能與植物基因組重組，存在一些生物安全方面的隱患，而人工miRNA只引入21個(gè)堿基的外源序列，降低了此類風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生；3) 田間病毒多是混合侵染，病毒株系多、變異快，RNAi等方法只能有效抵御部分株系，無(wú)法培育一種持久廣譜的抗病毒品種，amiRNA可以允許錯(cuò)配的存在，因而針對(duì)病毒保守區(qū)設(shè)計(jì)amiRNA，使之有效抑制大多數(shù)病毒株系，并且當(dāng)病毒發(fā)生突變后仍然能夠保持抗病毒能力；4) RNAi介導(dǎo)的基因沉默會(huì)產(chǎn)生一系列序列信息不明確的siRNAs，往往造成意外“脫靶”和非目標(biāo)基因的沉默等現(xiàn)象，amiRNA只產(chǎn)生1條miRNA成熟體 (Mature miRNA)，與靶基因的結(jié)合更加精確、可控和高效。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Development of transgenic maize with anti-rough dwarf virus artificial miRNA vector and their disease resistance

Ning Xuan1, Chuanzhi Zhao1, Zhenying Peng1, Gao Chen1, Fei Bian1, Mingzheng Lian1, Guoxia Liu1, Xingjun Wang1, and Yuping Bi1,2

1,,250100,,2,,250100,,

Maize is one of the most important food crops. Rice black-streaked dwarf virus is a maize rough dwarf disease pathogen. The occurrence and transmission of maize rough dwarf disease brings great damage to maize production. The technology of using artificial miRNA to build antiviral plant has been proven effective in a variety of plants. However, such trials in maize have not been reported. We designed primers based on the sequence of maize zea-miR159a precursor and sequence of function protein genes and silencing RBSDV coding genes in RBSDV genome. We constructed amiRNA (artificial miRNA) gene for silencing RBSDV coding gene and gene silencing suppressor. We constructed pCAMBIA3301-121-amiRNA plant expression vector for transforming maize inbred lines Z31 by using agrobacterium mediated method. After molecular analysis of transgenic maize, homozygous lines with high miRNA expression were selected by molecular detection for a subsequent natural infection experiment. We studied the severity of maize rough dwarf disease according to a grading standard (grade 0 to 4). The experiment results showed that the disease resistance of transgenic homozygous maize with the anti-rough dwarf virus amiRNA vector was better than that of wild type. Among the transgenic maize, S6-miR159 transgenic maize had high disease resistance. It is feasible to create new maize variety by the use of artificial miRNA.

amiRNA, maize rough dwarf disease, transgenic maize

10.13345/j.cjb.140637

December 24, 2014; Accepted:May 6, 2015

International Science & Technology Cooperation Program of China (No. 2012DFA30450), Foundation for Young Excellent Scientists in Shandong Province (No. BS2012SW019).

Yuping Bi. Tel: +86-531-83178227; E-mail: yupingbi@vip.sina.com

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(No. 2012DFA30450)，山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(No. BS2012SW019) 資助。

2015-06-26

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150626.1512.002.html