徐玲玲，郭偉，劉穎，張雪青，于俊濤，吳文才，趙鐵軍

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穩(wěn)恒磁場(chǎng)聯(lián)合抗腫瘤藥物協(xié)同殺傷肝癌細(xì)胞Hepa1-6

徐玲玲1，郭偉2，劉穎2，張雪青1，于俊濤1，吳文才1，趙鐵軍1

1 浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004 2 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119

徐玲玲, 郭偉, 劉穎, 等. 穩(wěn)恒磁場(chǎng)聯(lián)合抗腫瘤藥物協(xié)同殺傷肝癌細(xì)胞Hepa1-6. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(9): 1363–1374.Xu LL, Guo W, Liu Y, et al. Synergistic inhibitory effect of static magnetic field and antitumor drugs on Hepa1-6 cells. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1363–1374.

化學(xué)療法為腫瘤臨床治療的常規(guī)方法，存在毒副作用大、抗藥性強(qiáng)等缺陷。為了提高藥物的利用效率，減少藥物引起的毒副作用，將8.8 mT穩(wěn)恒磁場(chǎng)分別與順鉑、阿霉素聯(lián)用，經(jīng)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)磁場(chǎng)與藥物聯(lián)用可對(duì)肝癌細(xì)胞Hepa1-6生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制的效應(yīng)，經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示磁場(chǎng)能增加順鉑對(duì)G2/M期細(xì)胞的滯留，而磁場(chǎng)與阿霉素共同作用可將細(xì)胞阻止于G1期和G2/M期。經(jīng)彗星電泳檢測(cè)表明磁場(chǎng)能夠增強(qiáng)藥物對(duì)DNA的損傷，且原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組細(xì)胞膜表面出現(xiàn)較大且較深的孔洞，表面結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗腫瘤藥物與磁場(chǎng)聯(lián)用技術(shù)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，減少藥物的使用濃度，為將抗腫瘤藥物與磁場(chǎng)應(yīng)用于臨床治療惡性腫瘤提供了一個(gè)全新的思路與策略。

穩(wěn)恒磁場(chǎng)，順鉑，阿霉素，協(xié)同殺傷

腫瘤是機(jī)體局部組織的細(xì)胞在各種致瘤因素作用下異常增生而形成的贅生物，惡性腫瘤除了細(xì)胞失控性的增殖外，還伴有浸潤(rùn)性的生長(zhǎng) (即擴(kuò)散轉(zhuǎn)移)，嚴(yán)重危及到人類的生命與健康。因此，惡性腫瘤是危及人類生命與健康的嚴(yán)重疾病之一。腫瘤的內(nèi)科治療半個(gè)世紀(jì)以來(lái)取得很多重大進(jìn)展，是常見(jiàn)腫瘤綜合治療中不可缺少的重要手段，已經(jīng)和手術(shù)治療、放射治療并列成為防治腫瘤的三種主要手段之一?；瘜W(xué)藥物治療是最原始、也是最基本的內(nèi)科治療手段，目前國(guó)際上臨床常用的抗腫瘤藥物已達(dá)近百種。

順鉑 (cis-Dichlorodiamineplatinum，HDDP) 和阿霉素 (Doxorubicin hydrochloride，ADM) 作為臨床使用的經(jīng)典抗腫瘤藥物，對(duì)于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌及食道癌等多種類型腫瘤均能顯示療效，具有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用[1]。但與其他化療藥物一樣，順鉑和阿霉素也面臨著腫瘤細(xì)胞的耐藥性和藥物對(duì)人體的毒性，即抗癌藥物的毒副作用等缺陷。為了克服這些不足，增強(qiáng)藥物的治療效果，提高患者的生存期限，人們嘗試著聯(lián)合多種物理或化學(xué)方法共同治療腫瘤[2]。近年來(lái)核磁共振理論的發(fā)展與波譜技術(shù)的應(yīng)用，使生物磁學(xué)得到進(jìn)一步發(fā)展[3]，有學(xué)者開(kāi)始關(guān)注磁場(chǎng)結(jié)合化學(xué)藥物在腫瘤治療中應(yīng)用的可行性。大量研究資料表明磁場(chǎng)在某些條件下能夠影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[4-6]，而抗腫瘤藥物聯(lián)合磁場(chǎng)的方法不僅能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，還可以降低化療藥物的使用濃度，但其具體殺傷機(jī)制不明。本文將通過(guò)順鉑和阿霉素分別與穩(wěn)恒磁場(chǎng)聯(lián)合作用，研究對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果，重點(diǎn)探討磁場(chǎng)與藥物聯(lián)合作用后協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的具體機(jī)制，為未來(lái)將其應(yīng)用于臨床治療惡性腫瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞株Hepa1-6 (ATCC，CRL-1830) 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；MTT購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；DNA熒光染料為美國(guó)Coulter公司DNA染色試劑盒；順鉑，阿霉素，1%低熔點(diǎn)瓊脂糖及EB為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；四季青胎牛血清 (FBS) 為浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。本實(shí)驗(yàn)所用磁場(chǎng)處理系統(tǒng) (圖1) 由直流穩(wěn)壓電源 (GWL-305-2，上海新神電子儀器廠)、數(shù)字高斯計(jì) (HT20，上海亨通磁電)、長(zhǎng)直螺線管 (自制) 和控溫裝置組成[7]。其中，螺線管直徑78 mm，匝數(shù)2 000，工作電流2 A，高斯計(jì) (HT20，亨通磁電，上海，中國(guó)) 測(cè)定磁通密度的值為 (8.800±0.106) mT。培養(yǎng)箱中的溫度通過(guò)加熱器和熱控制器調(diào)控，以保持恒溫箱溫度恒定在 (36.5±0.5) ℃。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Hepa1-6細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM+10%胎牛血清和雙抗 (青霉素100 IU/mL，鏈霉素0.1 mg/mL) 的完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱及飽和水蒸氣條件下常規(guī)培養(yǎng)及傳代，使用對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性

細(xì)胞以1×105cells/mL的細(xì)胞密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為4組：1) 對(duì)照組，無(wú)SMF處理正常培養(yǎng)的細(xì)胞；2) 磁場(chǎng)組，磁場(chǎng)曝磁處理；3) 藥物組，不同濃度梯度藥物處理；4) 磁場(chǎng)加藥物組，磁場(chǎng)加藥物共同處理細(xì)胞。24 h后，制成細(xì)胞懸液接種于96孔板，加入MTT溶液10 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入100 μL裂解液室溫處理15 min，最后在595 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)值，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

圖1 靜磁場(chǎng) (SMF) 系統(tǒng)示意圖

1.2.3 細(xì)胞周期分析

離心收集細(xì)胞 (1 000 r/min、3 min)，磷酸鹽緩沖液 (Phosphate buffered saline，PBS) 清洗2次后，用60%?70%冷乙醇重懸細(xì)胞，保存于4 ℃。測(cè)樣時(shí)離心棄上清 (1 000 r/min、5 min)，PBS清洗2次后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105?1×106cells/mL。加入DNA熒光染料 (美國(guó)Coulter公司DNA染色試劑盒)，25 ℃避光染色30 min后，流式細(xì)胞儀 (美國(guó)BD公司) 檢測(cè)，Mod Fit LT for Mac V3.0軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 單細(xì)胞凝膠電泳 (Single cell gel electrophoresis，SCGE) 檢測(cè)DNA損傷

取待測(cè)細(xì)胞懸液與等量1%低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻凝固。用裂解緩沖液 (2.5 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，200 mmol/L NaOH，1%肌苷酸鈉，臨用前加入1% Triton和10% DMSO，pH 10) 裂解細(xì)胞60 min。蒸餾水漂洗后，置于電泳液 (1 mmol/L EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 13) 中解旋20 min，隨后在0.86 V/cm強(qiáng)度下電泳20 min。電泳后，用中和液 (0.4 mol/L Tris-HCl，pH 7.4) 清洗3次，從裂解至中和溫度控制在4 ℃下。隨后用70%和100%乙醇各脫水5 min，EB (20 μg/mL) 染色15 min，熒光顯微鏡Eclipse e600 (日本尼康公司) 拍照成像。CASP軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 原子力顯微鏡 (Atomic force microscope，AFM) 觀察

Hepa1-6細(xì)胞接種于爬片，1%戊二醛固定15 min，PBS清洗后晾干。制好的細(xì)胞樣品固定于AFM (SPM-9500J3，日本島津公司) 的樣品臺(tái)上 (XY掃描臺(tái))，掃描速度調(diào)整為1.0和1.5 hz之間的接觸模式，Si3N4探針 (日本奧林巴斯公司) 在大氣環(huán)境中用接觸模式 (Contact mode) 掃描成像，具體方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法檢測(cè)穩(wěn)恒磁場(chǎng)分別與順鉑、阿霉素與聯(lián)合作用后協(xié)同抑制細(xì)胞生長(zhǎng)

肝癌細(xì)胞Hepa1-6經(jīng)磁場(chǎng)與順鉑處理24 h后，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)濃度為1 μg/mL的順鉑以及該濃度順鉑聯(lián)合磁場(chǎng)后均對(duì)細(xì)胞有極顯著的殺傷 (<0.01)。與單純順鉑處理相比，磁場(chǎng)聯(lián)合順鉑作用后極顯著地降低了細(xì)胞活性 (<0.01) (圖2A)。如圖2B所示，肝癌細(xì)胞Hepa1-6經(jīng)磁場(chǎng)與阿霉素處理24 h后，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)濃度為50 ng/mL的阿霉素以及該濃度阿霉素聯(lián)合磁場(chǎng)后均對(duì)細(xì)胞有極顯著的殺傷 (<0.01)。與單純阿霉素處理相比，磁場(chǎng)聯(lián)合阿霉素作用后極顯著地降低了細(xì)胞活性 (<0.01)。當(dāng)濃度為20 ng/mL阿霉素作用細(xì)胞24 h后即可對(duì)細(xì)胞造成明顯殺傷 (<0.05)，磁場(chǎng)的存在顯然促進(jìn)了這一殺傷效果 (<0.01)；同時(shí)磁場(chǎng)促進(jìn)殺傷細(xì)胞的作用在兩組之間 (即阿霉素與聯(lián)合作用組之間) 形成顯著差異 (<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，24 h曝磁磁場(chǎng)可促進(jìn)順鉑或阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

2.2 HE染色觀察穩(wěn)恒磁場(chǎng)分別與順鉑、阿霉素聯(lián)合作用后細(xì)胞形態(tài)變化

Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)磁場(chǎng)與不同抗腫瘤藥物聯(lián)合處理后，HE染色結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)照組細(xì)胞貼壁鋪展充分，細(xì)胞核輪廊清晰，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)細(xì)胞核；曝磁24 h后鏡下可見(jiàn)細(xì)胞鋪展充分，胞質(zhì)染色略淺，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；1 μg/mL順鉑處理后細(xì)胞界限不明顯，胞漿空泡化且淺染，胞核染色變淡；磁場(chǎng)與1 μg/mL順鉑共處理后細(xì)胞形態(tài)變化明顯，由多角形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，細(xì)胞核淺染，核仁碎裂為多個(gè)。20 ng/mL阿霉素處理細(xì)胞質(zhì)淺染，胞核脹大且出現(xiàn)眾多較小的核仁；磁場(chǎng)與20 ng/mL阿霉素共處理后細(xì)胞內(nèi)空泡增多，部分胞核深染，核仁碎裂或消失。

圖2 順鉑、阿霉素分別聯(lián)合磁場(chǎng)處理細(xì)胞增殖結(jié)果

圖3 磁場(chǎng)與不同抗腫瘤藥物聯(lián)合處理Hepa1-6細(xì)胞后的HE染色圖(40×)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)穩(wěn)恒磁場(chǎng)分別與順鉑、阿霉素聯(lián)合作用后細(xì)胞周期分布

Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)磁場(chǎng)與1 μg/mL順鉑處理24 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn) (圖4)，單純磁場(chǎng)處理后細(xì)胞周期較對(duì)照組相比變化不大。而順鉑處理24 h后，S期細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組相比顯著增加 (<0.01)，而G1期和G2/M期的細(xì)胞較對(duì)照組顯著減少 (<0.01)。其原因是順鉑為細(xì)胞周期特異性的藥物，能將細(xì)胞阻滯于S期[9]。磁場(chǎng)結(jié)合1 μg/mL順鉑處理細(xì)胞24 h后，流式結(jié)果顯示細(xì)胞主要滯留于S期 (<0.01)，而G1期細(xì)胞比例繼續(xù)減少，為各組中細(xì)胞比例最少 (<0.01)；聯(lián)合組與單純順鉑組相比G2/M期細(xì)胞數(shù)相比升高明顯 (<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，磁場(chǎng)能增加順鉑作用后細(xì)胞在G2/M期的滯留。

Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)磁場(chǎng)與20 ng/mL阿霉素處理后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn) (圖5)，單純曝磁對(duì)Hepa1-6細(xì)胞周期分布影響不大，而阿霉素作用后G2/M期細(xì)胞比例增多 (<0.05)，提示阿霉素可將Hepa1-6細(xì)胞捕獲于G2/M期，這一結(jié)果與Mittal等研究結(jié)果一致[10]。20 ng/mL阿霉素與磁場(chǎng)共處理細(xì)胞后，G1與G2/M期細(xì)胞的比例增高，為各處理組中最高，而S期細(xì)胞的比例顯著降低 (<0.01)，為各處理組中最低。聯(lián)合組與阿霉素組相比G2/M期細(xì)胞數(shù)略有升高，G1期細(xì)胞數(shù)升高顯著 (<0.01)，而S期細(xì)胞數(shù)降低明顯 (<0.01)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，磁場(chǎng)與阿霉素共同作用可將細(xì)胞阻止于G1期和G2/M期。

圖4 穩(wěn)恒磁場(chǎng)聯(lián)合1 μg/mL順鉑處理Hepa1-6細(xì)胞后細(xì)胞周期的分布

圖5 穩(wěn)恒磁場(chǎng)聯(lián)合20 ng/mL阿霉素處理Hepa1-6細(xì)胞后細(xì)胞周期的分布

2.4 SCGE檢測(cè)穩(wěn)恒磁場(chǎng)分別與順鉑、阿霉素聯(lián)合作用后DNA損傷加劇

單細(xì)胞凝膠電泳又名彗星電泳 (Comet assay) 是一種測(cè)定和研究單個(gè)細(xì)胞DNA鏈斷裂的微電泳技術(shù)。無(wú)DNA鏈斷裂的細(xì)胞核熒光染色后呈圓形的細(xì)胞團(tuán)，無(wú)拖尾現(xiàn)象；有DNA損傷的細(xì)胞核在電場(chǎng)作用下斷鏈或碎片向陽(yáng)極遷移，形成“彗星”樣拖尾，損傷越重，斷鏈或碎片越多，彗尾越長(zhǎng)。經(jīng)CASP軟件分析后，選用DNA損傷最具有代表性的2個(gè)特征指標(biāo)，尾長(zhǎng) (Tail length) 和尾部DNA含量為DNA損傷參數(shù)。圖6為Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)磁場(chǎng)與順鉑處理后SCGE的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果表明單純磁場(chǎng)處理未對(duì)細(xì)胞DNA造成損傷 (>0.05)；1 μg/mL順鉑可對(duì)細(xì)胞DNA形成明顯損傷 (<0.01)；磁場(chǎng)與1 μg/mL順鉑聯(lián)合處理組與單純順鉑組相比差異極顯著 (<0.01)。表明磁場(chǎng)促進(jìn)了順鉑對(duì)細(xì)胞DNA的損傷。

Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)磁場(chǎng)與阿霉素處理后，彗星電泳的檢測(cè)表明單純磁場(chǎng)處理未對(duì)細(xì)胞DNA造成損傷 (>0.05)；20 ng/mL阿霉素可對(duì)細(xì)胞DNA形成明顯損傷 (<0.01)；磁場(chǎng)與20 ng/mL阿霉素聯(lián)合處理組與單純阿霉素組相比差異極顯著 (<0.01)。表明阿霉素對(duì)細(xì)胞DNA損傷能力可被磁場(chǎng)促進(jìn)。

圖6 彗星電泳檢測(cè)Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)1 μg/mL順鉑(A)與磁場(chǎng)(B)處理24 h后DNA損傷的結(jié)果

圖7 彗星電泳檢測(cè)Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)20 ng/mL阿霉素(A) 與磁場(chǎng) (B)處理24 h后DNA損傷的結(jié)果

2.5 AFM觀察穩(wěn)恒磁場(chǎng)分別與順鉑、阿霉素聯(lián)合作用后對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷

Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)穩(wěn)恒磁場(chǎng)分別與順鉑、阿霉素處理24 h后，原子力顯微鏡觀察細(xì)胞表面形貌后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞表面較為光滑，有少量較淺的凹陷存在 (圖8，C)；曝磁24 h后細(xì)胞表面更為光滑 (圖8，MF)。1 μg/mL順鉑作用細(xì)胞后在其表面形成不同尺度的圓形孔洞，孔洞周邊可見(jiàn)較為整齊的隆起圍繞分布 (圖8，HDDP)；磁場(chǎng)聯(lián)合1 μg/mL順鉑在細(xì)胞表面形成較大的孔洞，同時(shí)細(xì)胞表面變得較為粗糙，經(jīng)放大觀察到孔洞周邊較為平滑 (圖8，MF+HDDP)。20 ng/mL阿霉素可使細(xì)胞表面產(chǎn)生較大突起和許多較小的圓形孔洞 (圖8，ADM)；磁場(chǎng)與20 ng/mL阿霉素共處理后細(xì)胞表面粗糙度增加，孔洞樣結(jié)構(gòu)變大，表面突起增加 (圖8，MF+ADM)。提示磁場(chǎng)可能增強(qiáng)了藥物對(duì)細(xì)胞膜通透性的變化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)吞活動(dòng)增加，使攝入藥物量加大，提高了用藥效率。

3 討論

3.1 抗腫瘤藥物聯(lián)合磁場(chǎng)在腫瘤治療中的運(yùn)用

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康目前臨床上雖然已有數(shù)幾十種有效的抗腫瘤藥物，但是因其療效的不確定性，加之所存在的不良反應(yīng)，使癌癥患者的治愈情況依舊不容樂(lè)觀，而且其預(yù)后效果不理想[11]。這主要原因在于，在臨床使用抗癌藥物的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生耐藥性，而使用大劑量藥物，又對(duì)正常組織細(xì)胞和機(jī)體造成損傷，即所謂抗癌藥物的毒副作用。因此，研發(fā)更加高效的新型抗腫瘤藥物治療方法迫在眉睫。大量研究工作表明磁場(chǎng)或電磁場(chǎng)能直接影響在體腫瘤或離體腫瘤細(xì)胞，使瘤體或腫瘤細(xì)胞的特性發(fā)生改變，生長(zhǎng)被抑制[12-14]。如Rosen等報(bào)道了GH3細(xì)胞在0.5 T穩(wěn)恒磁場(chǎng)長(zhǎng)時(shí)間曝磁后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)降低了51%，細(xì)胞直徑和細(xì)胞骨架都發(fā)生了明顯的變化[15]?？鼓[瘤藥物聯(lián)合磁場(chǎng)的方法如能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低化療藥物的使用濃度，將為腫瘤治療提供一個(gè)新的技術(shù)手段，因此已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。例如，Sabo等用5-氟尿嘧啶、順鉑、阿霉素和長(zhǎng)春新堿的混合藥物聯(lián)合穩(wěn)恒磁場(chǎng)處理HL-60細(xì)胞，MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藥物聯(lián)合磁場(chǎng)可對(duì)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同殺傷作用，得到磁場(chǎng)可能增強(qiáng)抗腫瘤藥物毒性的推測(cè)[16]。Ruiz Gómez等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗腫瘤藥物 (長(zhǎng)春新堿、絲裂霉素C、順鉑) 聯(lián)合脈沖電磁場(chǎng)同時(shí)處理HCA-2/1cch (人腺腫瘤細(xì)胞亞系) 細(xì)胞時(shí)，脈沖電磁場(chǎng)能削弱細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的效果。但是先用藥物處理細(xì)胞1 h，之后再經(jīng)磁場(chǎng)處理2 d的實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有得到明顯的抑制細(xì)胞增殖的效果[12]。表明抗腫瘤藥物聯(lián)合磁場(chǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的協(xié)同殺傷效應(yīng)不僅受到藥物類型影響，還與藥物濃度、磁場(chǎng)頻率、處理時(shí)間有關(guān)。

圖8 磁場(chǎng)與不同抗腫瘤藥物聯(lián)合處理Hepa1-6細(xì)胞AFM觀測(cè)細(xì)胞表面形貌圖

3.2 抗腫瘤藥物聯(lián)合磁場(chǎng)協(xié)同殺傷機(jī)制的探討

本文證實(shí)將抗腫瘤藥物與8.8 mT穩(wěn)恒磁場(chǎng)聯(lián)合作用的方法不僅能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，還可以提高藥物的利用效率，減少藥物引起的毒副作用。Teodori等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)6 mT靜磁場(chǎng)處理后HL-60白血細(xì)胞的活性和凋亡率改變并不明顯，但是藥物與磁場(chǎng)聯(lián)用后膜的完整性被加速破壞，凋亡細(xì)胞轉(zhuǎn)向二級(jí)壞死細(xì)胞的速率明顯提高[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物與磁場(chǎng)聯(lián)合處理組的細(xì)胞膜表面出現(xiàn)較大且較深的孔洞，表面結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。提示磁場(chǎng)可能增強(qiáng)了藥物對(duì)細(xì)胞膜通透性的變化，提高抗腫瘤藥物的內(nèi)流，使攝入藥物量加大，從而提高了用藥效率。另外，Miyakoshi等還報(bào)道，10 T的靜磁場(chǎng)可以誘導(dǎo)DNA損傷，當(dāng)與X射線聯(lián)合作用后可導(dǎo)致細(xì)胞微核形成率有極顯著的增加[18]。我們的SCGE實(shí)驗(yàn)表明抗腫瘤藥物順鉑、阿霉素分別單獨(dú)作用時(shí)，皆可對(duì)細(xì)胞DNA造成損傷，但藥物與磁場(chǎng)聯(lián)用后，細(xì)胞DNA損傷加劇。流式結(jié)果發(fā)現(xiàn)磁場(chǎng)與順鉑聯(lián)用后，與單純順鉑組相比G2/M期細(xì)胞數(shù)相比升高明顯，而磁場(chǎng)與阿霉素共同作用可將細(xì)胞阻止于G1期和G2/M期。眾所周知，DNA損傷應(yīng)答是細(xì)胞內(nèi)一種非常保守的抵御外界及內(nèi)在因素誘導(dǎo)的DNA損傷的機(jī)制，是由多條信號(hào)傳導(dǎo)通路構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)來(lái)監(jiān)測(cè)和傳遞損傷信號(hào)，形成應(yīng)答機(jī)制例如細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的激活等[19]。當(dāng)細(xì)胞處于周期進(jìn)程中時(shí)，如果DNA的損傷且無(wú)法迅速修復(fù)時(shí)，會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)使周期進(jìn)程暫停，以便使細(xì)胞有充足的時(shí)間來(lái)修復(fù)損傷[20]。我們的實(shí)驗(yàn)表明抗腫瘤藥物聯(lián)合磁場(chǎng)有可能是通過(guò)誘導(dǎo)DNA損傷，從而激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)，例如G2/M期細(xì)胞的滯留，以達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。

3.3 抗腫瘤藥物聯(lián)合磁場(chǎng)應(yīng)用于腫瘤治療中的可行性

順鉑是中心以二價(jià)鉑同兩個(gè)氯原子和兩個(gè)氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，當(dāng)它進(jìn)入細(xì)胞后可在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生水解，氯配體被水分子取代，產(chǎn)生一種帶正電荷的物質(zhì)cis-[Pt(NH3)2(H2O)2]+2，該物質(zhì)不易穿過(guò)細(xì)胞膜，因而滯留在細(xì)胞內(nèi)并作用于細(xì)胞DNA上的堿基嘌呤(N7)，將其取代配位水，形成cis-[Pt(NH3)2]/DNA加合物，使DNA鏈發(fā)生扭曲，從而抑制DNA的復(fù)制過(guò)程，引發(fā)細(xì)胞毒反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21]。阿霉素結(jié)構(gòu)中的蒽醌可以嵌合到DNA中，每6個(gè)堿基對(duì)嵌入2個(gè)蒽醌環(huán)，從而使得堿基對(duì)之間的距離由原來(lái)的0.34 nm增至0.68 nm，引起DNA的裂解[22]。順鉑與阿霉素皆是廣譜的抗腫瘤藥物，對(duì)多種腫瘤均有抑制作用且療效顯著，但臨床證實(shí)順鉑、阿霉素的使用會(huì)出現(xiàn)諸如骨髓抑制，腎臟、神經(jīng)毒性、過(guò)敏等多種不良反應(yīng)。為了提高腫瘤的治愈率，增強(qiáng)療效，物理因素例如磁場(chǎng)與抗腫瘤藥物的結(jié)合，可能成為應(yīng)用于腫瘤臨床治療新的研究熱點(diǎn)。

本研究證實(shí)離體條件下，順鉑、阿霉素分別與磁場(chǎng)聯(lián)合作用于Hepa1-6細(xì)胞后，可以協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)也有相關(guān)在體實(shí)驗(yàn)報(bào)告表明，磁場(chǎng)能增強(qiáng)荷瘤動(dòng)物對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，提高動(dòng)物生存期限。Ostrovskaia等發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度電磁場(chǎng)和低濃度阿霉素分別作用小鼠在體Lewis肺癌，對(duì)腫瘤的抑制率為40%和35%，兩者聯(lián)用后對(duì)腫瘤抑制率可達(dá)85%[23]。Donata等發(fā)現(xiàn)，587 mT靜磁場(chǎng)可以顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的血管生成，并且使腫瘤部位微血管的通透性增強(qiáng)。當(dāng)對(duì)小鼠使用紫杉醇進(jìn)行化療時(shí)，磁場(chǎng)顯著地增強(qiáng)了紫杉醇的療效[24]。因此，我們有理由相信抗腫瘤藥物聯(lián)合磁場(chǎng)的方法將為未來(lái)臨床腫瘤的治愈提供一個(gè)全新的思路與策略。雖然目前已有許多關(guān)于抗腫瘤藥物與磁場(chǎng)結(jié)合后顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，成功治療腫瘤動(dòng)物模型的報(bào)道[25-26]，但要將其應(yīng)用于人類腫瘤臨床治療，其具體作用機(jī)制還未完全探究清楚，而且應(yīng)用安全性也有待于進(jìn)一步的研究與論證。因此，若將抗腫瘤藥物聯(lián)合磁場(chǎng)作為一種新的腫瘤綜合治療手段，還需對(duì)藥物類型、濃度、磁感應(yīng)強(qiáng)度、頻率、治療時(shí)間以及應(yīng)用安全性等因素進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步展開(kāi)探索，以取得最好效果，其研究結(jié)果將有益于提高人類的健康。

[1] Johnstone TC, Park GY, Lippard SJ. Understanding and improving platinum anticancer drugs-phenanthriplatin. Anticancer Res, 2014, 34(1): 471–476.

[2] Mouawad F, Gros A, Rysman B, et al. The antitumor drug F14512 enhances cisplatin and ionizing radiation effects in head and neck squamous carcinoma cell lines. Oral Oncol, 2014, 50(2): 113–119.

[3] Tenuzzo B, Chionna A, Panzarini E, et al.Biological effects of 6 mT static magnetic fields: a comparative study in different cell types. Bioelectromagnetics, 2006, 27(7):560–577.

[4] Ghodbane S, Lahbib A, Sakly M, et al. Bioeffects of static magnetic fields: oxidative stress, genotoxic effects, and cancer studies. Biomed Res Int, 2013, (2013): 602987.

[5] Vergallo C, Piccoli C, Romano A, et al. Magnetostatic field system for uniform cell cultures exposure. PLoS ONE, 2013, 8(8): e72341.

[6] Luciana D, Luigi A. Bioeffects of moderate-intensity static magnetic fields on cell cultures. Micron, 2005, 36: 195–217.

[7] Chen WF, Qi H, Sun RG, et al. Static magnetic fields enhanced the potency of cisplatin on k562 cells. Cancer Biother Radiopharm, 2010, 25(4): 401–408.

[8] Zhuang LN, Qi H, Sun RG, et al. Real time observation on cells in different fixed conditions and living cells in buffer solution by AFM. Acta Biophys Sin, 2005, 21(5): 345–350 (in Chinese).莊樂(lè)南, 齊浩, 孫潤(rùn)廣. 不同固定條件下細(xì)胞與活細(xì)胞的原子力顯微鏡實(shí)時(shí)觀察. 生物物理學(xué)報(bào), 2005, 21(5): 345–350.

[9] Fan Y, Wang L, Han X, et al. Rab25 is responsible for phosphoinositide 3-kinase/AKT?mediated cisplatin resistance in human epithelial ovarian cancer cells. Mol Med Rep, 2014, 11(3): 2173–2178.

[10] Mittal A, Tabasum S, Singh RP. Berberine in combination with doxorubicin suppresses growth of murine melanoma B16F10 cells in culture and xenograft. Phytomedicine, 2014, 21(3): 340–347.

[11] Dini L, Panzarini E. The influence of a 6 mT static magnetic field on apoptotic cell phagocytosis depends on monocyte/macrophage differentiation. Exp Biol Med (Maywood), 2010, 235(12): 1432–1441.

[12] Ruiz-Gómez MJ, de la Pe?a L, Prieto-Barcia MI, et al. Influence of 1 and 25 Hz, 1.5 mT magnetic fields on antitumor drug potency in a human adenocarcinoma cell line. Bioelectromagneties, 2002, 23(8): 578–585.

[13] Sullivan K, Balin AK, Allen RG, et al. Effects of static magnetic fields on the growth of various types of human cells. Bioelectromagnetics, 2011, 32(2): 140–147.

[14] Kroupováa J, Bártová E, Fojt L, et al. Low-frequency magnetic field effect on cytoskeleton and chromatin. Bioelectrochemistry, 2007, 70: 96–100.

[15] Rosen AD, Chastney EE. Effect of long term exposure to 0.5 T static magnetic fields on growth and size of GH3 cells. Bioelectromagnetics, 2009, 30(2): 114–119.

[16] Sabo J, Mirossay L, Horovcak L, et al. Effects of static magnetic field on human leukemic cell line HL-60. Bioelectrochemistry, 2002, 56(1/2): 227–231.

[17] Teodori L, Grabarek J, Smolewski P, et al. Exposure of cells to static magnetic field accelerates loss of integrity of plasma membrane during apoptosis. Cytometry, 2002, 49(3): 113–118.

[18] Miyakoshi J. Biological responses to extremely low-frequency electromagnetic fields. J Dermatol Sci Suppl, 2006, 2(1): 23–30.

[19] Kupfer GM. Fanconi anemia: a signal transduction and DNA repair pathway. Yale J Biol Med, 2013, 86(4): 491–497.

[20] Salvador JM, Brown-Clay JD, Fornace AJ Jr. Gadd45 in stress signaling, cell cycle control, and apoptosis. Adv Exp Med Biol, 2013, 793: 1–19.

[21] Macciò A, Madeddu C. Cisplatin: an old drug with a newfound efficacy-from mechanisms of action to cytotoxicity. Expert Opin Pharmacother, 2013, 14(13): 1839–1857.

[22] Jamieson D, Boddy AV. Pharmacogenetics of genes across the doxorubicin pathway. Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2011, 7(10): 1201–1210.

[23] Ostrovskaia LA, Budnik MI, Korman DB, et al. Antitumor effect of joint action of low intensity electromagnetic fields and ultra low doses of doxorubicin. Radiats Biol Radioecol, 2003, 43(3): 351–354.

[24] Donata G, Sven B, Sebastian S. Static magnetic fields increase tumor microvessel leakiness and improve antitumoral efficacy in combination with paclitaxel. Cancer Lett, 2014, 343(1): 107–114.

[25] Saunders R. Static magnetic fields: animal studies. Prog Biophys Mol Biol, 2005, 87(2/3): 225–239.

[26] Barazzuol L, Burnet NG, Jena R, et al. A mathematical model of brain tumour response to radiotherapy and chemotherapy considering radiobiological aspects. J Theor Biol, 2010, 262(3): 553–565.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Synergistic inhibitory effect of static magnetic field and antitumor drugs on Hepa1-6 cells

Lingling Xu1, Wei Guo2, Ying Liu2, Xueqing Zhang1, Juntao Yu1, Wencai Wu1, and Tiejun Zhao1

1 College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, Zhejiang, China 2 College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, Shaanxi, China

Chemotherapy as a routine method for clinical treatment of cancer has disadvantages such as significant toxicity and strong resistance. In order to improve the efficacy of the drugs and reduce the by-effects, we tried to combine static magnetic field (SMF) with cisplatin or adriamycin. The growth of Hepa1-6 cells treated with the static magnetic field (SMF) combined with cisplatin or adriamycin was significantly inhibited, as detected with MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide) test. Combined treatment group cells underwent significant morphological changes as observed by HE (Hematoxylin and eosin) staining under optical microscope. Cell cycle analysis indicated that SMF increased the ratio of cells arrested in G2/M phase caused by cisplatin, and when treated with SMF combined with adriamycin, cells were almost arrested in G1 and G2/M phase. SCGE test showed that SMF can enhance the ability of cisplatin or adriamycin to promote cell DNA damage. Atomic force microscope observation found that the combination of antitumor drugs and magnetic field treatment induced larger and deeper holes on the cell membrane, and surface structure damage is serious. The combination of antitumor drugs and magnetic field technology effectively inhibits the growth of tumor cells, and reduces drug doses. The results implicate this method as potential cancer therapy.

static magnetic field (SMF), cisplatin, adriamycin, synergistic inhibitory effect

10.13345/j.cjb.140483

October 14, 2014; Accepted:December 10, 2014

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31470262, 31200128), Science and Technology Plans of Shaanxi Province (No. 2006C234), Open Fund for a Key-key “bilolgy” Discipline of Zhejiang Province (No. KFJJ2014003).

Lingling Xu. Tel: +86-579-82291410; E-mail: xll0518@zjnu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31470262, 31200128)，陜西省科技計(jì)劃 (No. 2006C234)，浙江省“重中之重”學(xué)科“生物學(xué)”2014年度開(kāi)放基金 (No. KFJJ2014003) 資助。