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高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器法檢測茶葉中摻雜糖類物質(zhì)

陳 琦1*，李 立2，吳雪原1，儲曉剛2，許姍姍1，李德軍1，胡 堅1

（1. 黃山出入境檢驗檢疫局茶葉質(zhì)量安全研究中心，安徽 黃山 245000；

2. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

〔摘 要〕使用超聲提取與分散基質(zhì)固相萃取對茶葉中蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖進(jìn)行提取和凈化，使用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器（ELSD）法對茶葉4種糖進(jìn)行測定，蔗糖、葡萄糖、果糖在50 ug/mL～500 ug/mL的線性范圍，半乳糖在25 ug/mL～250 ug/mL的線性范圍，各組分響應(yīng)峰面積與其相應(yīng)濃度呈良好相關(guān)性，r>0.995。蔗糖、葡萄糖和果糖在2%，5%，20%添加水平下，半乳糖在1%，2.5%，10%的添加水平下，回收率為92 %～102 %，精密度為0.99%～2.26%。對黃山市休寧縣和黟縣兩個茶葉產(chǎn)區(qū)的茶葉進(jìn)行采樣分析，并對其中蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖進(jìn)行測定以及分析統(tǒng)計。通過對陽性樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)：當(dāng)黃山地區(qū)夏秋茶中的蔗糖含量在10%以上，可以基本確定摻加了蔗糖；蔗糖含量在3%～7%之間的為可疑樣品。

〔關(guān)鍵詞〕茶葉；糖；摻雜；液相色譜；蒸發(fā)光檢測器

來自中國茶網(wǎng)的報道：“茶葉加糖和噴漿成為了潛規(guī)則， 加糖和噴漿主要是對夏秋茶加糖或噴漿達(dá)到美化外形和改善口感的目的，由于夏秋茶的茶葉嫩度差，外形松散，只有通過糖的粘性特性來達(dá)到收縮外形的目的，通過加糖也能大大提升茶葉的光澤度，更有甚者，通過添加大量的糖來增加茶葉的重量”（http://www.chinateaw.net/）。茶葉中糖類物質(zhì)摻雜使假已成為我們面臨的重大問題。另外一方面，由于夏秋茶葉中多酚物質(zhì)含量高，氨基酸含量低，口感苦澀，適量的加糖能夠有效的改善口感，降低苦澀感?！禛B/T 2760- 2011食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定：食品添加劑使用時，不應(yīng)掩蓋食品本身或加工過程中的質(zhì)量缺陷或以摻雜、摻假、偽造為目的而使用[1]。

目前針對茶葉摻雜使假行為有一定的檢測手段：使用標(biāo)準(zhǔn)方法對茶葉中的灰分[2]、水浸出物進(jìn)行測定來初步判斷摻雜使假；使用熒光PRC鑒定茶葉中小麥摻雜[3]；使用原子吸收光譜法鑒定石灰、硫酸鎂等礦物質(zhì)的摻偽[4]；熱分析法檢測苦丁茶摻雜葡萄糖[5]。目前用于茶葉摻偽鑒定主要還是依靠感官審評進(jìn)行判斷。無論是用感官鑒定還是理化檢測，都很難評測茶葉中糖類物質(zhì)含量是否符合正常范圍。檢測食品單糖和雙糖的方法有化學(xué)法、液相色譜法等[6- 8]和質(zhì)譜法[ 9]。本研究開展高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器（ELSD）法對茶葉中蔗糖、葡萄糖、果糖進(jìn)行測定以及T分布分析統(tǒng)計，來達(dá)到識別茶葉中糖類物質(zhì)摻雜使假鑒定的目的。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

樣品：茶葉采摘于黃山休寧縣和黟縣（由黃山本地茶廠按照給定工藝加工）。

乙腈（色譜純）；超純水；固相萃取填料：石墨化碳（Carb）填料、N-丙基乙二胺（PSA）固相萃取填料和C18固相萃取填料（Agilent, 120 μ m）。

蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99 %，百靈威）。

1.2儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀（美國Agilent，配有1260 ELSD）；渦旋混勻器；離心機（德國Hettich）。

1.3方法

1.3.1各種溶液的配制

4種糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取0.25g蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，加水定容，配置5 mg/mL蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲備標(biāo)準(zhǔn)液。

4種糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取2 mL 蔗糖、2 mL葡萄糖、2 mL果糖和1 mL半乳糖儲備標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，定容至刻度。

1.3.2樣品前處理

稱取茶葉2.00 g置于50 mL離心管中，加入20 mL純水，渦旋振蕩2min，超聲處理1 min，最后離心5min（5000 rpm）。取1 mL上清液置于離心管中，加入1 mL乙腈，使用50 mg PSA固相萃取填料渦旋凈化1 min，離心5min(6000 rpm)，過0.22μ m有機系濾膜，稀釋合適的倍數(shù)進(jìn)行分析。

1.3.3色譜分析

液相色譜柱：NH2柱（5μ m，4.6×250mm，GL Sciences Inc，日本）；色譜柱溫：40℃；檢測器：蒸發(fā)光檢測器（ELSD）；流動相：乙腈-水（70:30 （v/v））；流速1 mL/min；進(jìn)樣體積：5μ L。

ELSD參數(shù)：蒸發(fā)溫度 90℃，霧化溫度 50℃，氮氣流速1.0L/min(SLM)。

2　結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

流動相比例的選擇：流動相比例影響流動相的洗脫能力，水相比例越高，洗脫能力越強，但是分離度越低，水相比例降低，洗脫能力減小，分離度隨之增加，但是容易造成色譜峰展寬和拖尾，對靈敏度和分離效果產(chǎn)生不良影響。本研究比較了乙腈與水比例為80:20（v/v），70:30（v/v），60:40（v/v）和50:50（v/v）的分離效果，結(jié)果表明當(dāng)乙腈與水比例為70:30（v/v）分離效果和靈敏度最為理想（見圖1）。

2.2儀器檢出限、檢測限及線性

蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖的儀器檢出限按信噪比（S/N=10）計算，蔗糖50 ug/mL，葡萄糖50 ug/mL，果糖50 ug/mL，半乳糖25 ug/mL的濃度下，其信噪比≥10；蔗糖1000 ug/mL，葡萄糖1000 ug/mL， 果糖1000 ug/mL，半乳糖1000 ug/mL的濃度下，其ELSD響應(yīng)飽和，出現(xiàn)了平頭色譜峰，蔗糖、葡萄糖、果糖在50 ug/mL～500 ug/mL的線性范圍內(nèi)建立校準(zhǔn)曲線，其線性系數(shù)≥0.995；半乳糖在25 ug/mL～250 ug/mL的線性范圍內(nèi)建立校準(zhǔn)曲線，其線性系數(shù)≥0.995。4種糖類物質(zhì)的儀器檢出限及線性范圍見表1。

圖1　四種糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖

表1　方法的線性實驗結(jié)果和檢出限

2.3前處理優(yōu)化

蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖均為水溶性化合物，在水中易溶，因此選擇純水作為提取溶劑，在提取茶葉中單雙糖的同時，茶葉中的一些水溶性物質(zhì)也被提取出來，會對糖的色譜分析造成干擾，因此需要對提取液進(jìn)行凈化，茶葉中水溶性物質(zhì)主要有氨基酸、生物堿、有機酸、黃酮類物質(zhì)、花青素及茶多酚氧化產(chǎn)物茶黃素、條紅素和茶褐素，本研究考慮了不同固相萃取填料在不同的溶劑體系中的凈化效果。

2.3.1 固相萃取填料的選擇

對茶葉水溶液中的干擾物質(zhì)有吸附作用的主要有石墨化碳（Carb）填料、N-丙基乙二胺（PSA）固相萃取填料和C18固相萃取填料，PSA吸附劑能有效去除樣品中的脂肪酸等極性基質(zhì)雜質(zhì)，C18吸附劑能去除部分非極性脂肪和脂溶性雜質(zhì)，石墨化碳黑能去除色素和固醇類雜質(zhì)。實驗對不同固相萃取填料對四種糖類物質(zhì)的吸附率進(jìn)行測試，結(jié)果表明三種固相萃取填料在水或乙腈-水（1：1）中對目標(biāo)分析物無明顯吸附。但是，通過對樣品基質(zhì)加標(biāo)得到的提取溶液進(jìn)行凈化，實驗發(fā)現(xiàn)PSA對樣品基質(zhì)的凈化效果最好。

在2 mL的200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（溶劑為水）分別添加50 mg PSA、C18、Carb進(jìn)行凈化處理，吸附處理結(jié)果表明：三種固相萃取填料在水溶液中對四種糖類物質(zhì)無明顯吸附。

在2 mL的200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（溶劑為乙腈-水（1：1））分別添加50 mg PSA、C18、Carb進(jìn)行凈化處理，吸附處理結(jié)果表明：三種固相萃取填料在乙腈-水（1：1）溶液中對四種糖類物質(zhì)無明顯吸附。

2.3.2 提取液的溶劑體系對凈化效果影響

確定了凈化固相萃取填料后，為了降低溶劑對提取液中水溶性的雜質(zhì)的保留能力，研究往提取水溶液中加入乙腈等有機溶劑降低溶劑的極性來減少色素、有機酸和少量蛋白質(zhì)、氨基酸等水溶性雜質(zhì)在溶液中的保留強度，增加固相萃取填料吸附效率。實驗結(jié)果表明：往提取液中加入等體積的乙腈可以有效的增加PSA固相萃取填料對水溶性雜質(zhì)的吸附效率。

2.4檢測方法的回收率和精密度

使用正常加工得到的茶葉樣品，分別添加2%，5%和20%的蔗糖、葡萄糖和果糖以及1%，2.5%和10%的半乳糖。每個添加水平樣品平行測定7次，同時測定樣品中的糖含量，減去茶葉本身的含糖量計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。

表2　方法的準(zhǔn)確度和精密度實驗結(jié)果(%)

3　休寧縣及黟縣夏秋茶固有含糖量統(tǒng)計分析

對黃山的休寧縣和黟縣兩個主要出口茶葉地區(qū)不同地點進(jìn)行采樣，經(jīng)過采摘→攤涼→殺青（220℃）→揉捻→初烘（120℃，10 min）→足干（90℃，20 min）步驟進(jìn)行加工，對這兩個地區(qū)的夏秋茶樣品（樣本量均為27個）進(jìn)行檢測，所有樣品均未檢出半乳糖，統(tǒng)計分析結(jié)果見表3。

在樣品量足夠的前提下，對相同時間相同地區(qū)采摘的茶葉中的各種糖含量利用T分布進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過計算樣品的中位值和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果顯示：

休寧縣的夏秋茶：果糖含量的中位值為0.15 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.11 %；葡萄糖含量的中位值為0.18 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.07 %；蔗糖含量的中位值為1.07 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.43 %。

黟縣的夏秋茶：果糖含量的中位值為0.12%，標(biāo)準(zhǔn)差0.06%；葡萄糖含量的中位值為0.22 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.10 %；蔗糖含量的中位值為0.94 %，標(biāo)準(zhǔn)差0.60 %。

表3　黃山地區(qū)的茶葉中含糖量的統(tǒng)計分析

4　樣品檢測分析

茶葉加糖是為了對夏秋茶進(jìn)行美化外形，由于夏秋茶的茶葉嫩度差、外形松散，通過糖的粘性特性來可以達(dá)到收縮外形的目的，也能大大提升茶葉的光澤度，更有甚者，通過添加大量的糖來達(dá)到增加茶葉的重量的目的。通過到茶葉生產(chǎn)企業(yè)調(diào)查研究，要達(dá)到收縮茶葉外形和提升茶葉的光澤度的目的，加糖量通常在5%～25%之間，因此在進(jìn)行糖添加陽性樣品分析時，需要對提取和凈化后的溶液稀釋25倍，確保進(jìn)樣液中糖類物質(zhì)濃度在線性范圍內(nèi)再進(jìn)行色譜定量分析。

通過對出口茶葉及市場上的低端茶葉進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有蔗糖添加可疑樣品，檢測到的含量分別為8.92%、19.32 %、17.20 %、12.05 %、14.89 %、14.83 %、23.53 %、18.38 %、17.19 %、13.21 %、20.71 %和10.44 %，未發(fā)現(xiàn)有蔗糖含量在3%～7%之間的樣品，也未檢測果糖和葡萄糖含量異常的樣品。

以上證據(jù)表明：當(dāng)夏秋茶中的蔗糖含量在10%以上，可以基本確定摻加了蔗糖；當(dāng)蔗糖含量在3%～7%之間的樣品，為可疑樣品。

〔參考文獻(xiàn)〕

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（責(zé)任編輯：章傳政）

〔收稿日期〕2014-10-13

〔文章編號〕1006-5768(2015)01-0026-04

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕TS201