凋亡相關(guān)基因c-myc在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

安金路蔣軍廣孫曼崔永亮張艷梅郭世放宋衛(wèi)衛(wèi)

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省呼吸疾病研究所河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450052)

摘要〔〕目的探討凋亡相關(guān)基因c-myc在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及臨床意義。方法免疫組織化學(xué)法檢測c-myc在NSCLC(50例)及正常肺組織(20例)中的表達(dá)，TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果c-myc在NSCLC及正常肺組織間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.150，P=0.002)。c-myc在腺癌中的表達(dá)率高于在肺鱗癌中(χ2=5.918，P=0.015)。高分化組織的陽性表達(dá)率高于中分化和低分化(χ2=7.888，P=0.019 )。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(χ2=4.327，P=0.038)。TNM Ⅲ期和Ⅳ期陽性率高于Ⅰ期和Ⅱ期(χ2=7.484，P=0.006)。c-myc與細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.784，P=0.000)。c-myc的表達(dá)與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、腫瘤位置、胸腔積液無明顯關(guān)系(P>0.05)。結(jié)論c-myc與NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展、臨床分期、惡性程度關(guān)系密切。

關(guān)鍵詞〔〕c-myc；肺腫瘤；細(xì)胞凋亡；免疫組織化學(xué)

中圖分類號〔〕R734.2〔

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(102102310133)

通訊作者：蔣軍廣(1963-)，男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授，主要從事呼吸疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

第一作者：安金路(1990-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤。腫瘤和凋亡關(guān)系密切，腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要原因是誘導(dǎo)凋亡基因失活，抑制凋亡基因過度表達(dá)。目前對c-myc在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及臨床意義已有研究，結(jié)果并不一致，而c-myc與細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究尚少。本研究探討c-myc在NSCLC中發(fā)生、發(fā)展中的作用，期望為NSCLC的預(yù)防、診斷、治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1對象與方法

1.1對象隨機(jī)選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2010～2012年經(jīng)我院胸外科切除的NSCLC標(biāo)本50例，年齡44～77歲，年齡≥60歲28例，<60歲22例；所有患者手術(shù)前均未接受放化療及其他治療且病理診斷明確。按照美國聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)和國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期〔1〕。其中男33例，女17例；鱗癌27例，腺癌23例；高分化9例，中分化26例，低分化15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例；TNM分期Ⅰ期加Ⅱ期共31例，Ⅲ期加Ⅳ期共19例；吸煙23例，不吸煙27例；腫瘤直徑>3 cm者32例，≤3 cm者18例；腫瘤位于左側(cè)20例，右側(cè)30例；有胸腔積液者9例，無胸腔積液者41例。另選取20例距NSCLC癌旁3 cm以上正常組織(病理證實(shí))為對照組。

1.2方法

1.2.1主要試劑Rabbit Anti-MTLC/c-myc、羅氏TUNEL凋亡檢測試劑盒、免疫組化染色試劑盒來自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；濃縮型DAB試劑盒來自北京中杉生物工程公司。

1.2.2S-P法染色50例NSCLC組織及20例正常肺組織切片放入60℃恒溫烤箱里30 min；梯度酒精脫蠟、水化；磷酸鹽緩沖液(PBS)抗原修復(fù)；3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；非免疫性動(dòng)物血清阻斷非特異性反應(yīng)；滴加一抗，放入4℃冰箱過夜；第2天滴加生物素化標(biāo)記的二抗；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；梯度酒精脫水；中性樹膠封片。

1.2.3TUNEL法烤片、脫蠟、脫水；Proteinase K工作液處理癌組織切片；TUNEL反應(yīng)混合液處理肺癌組織；滴加converter-POD；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；梯度酒精脫水；中性樹膠封片。

1.2.4陽性結(jié)果判斷免疫組化結(jié)果判定：c-myc在肺鱗癌中的主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，肺腺癌中主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，陽性表達(dá)均呈現(xiàn)棕黃色顆粒。從兩方面進(jìn)行定量判斷，①陽性染色程度：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②染色細(xì)胞百分率，高倍鏡(400倍)下每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，每張切片隨機(jī)挑選10個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總癌細(xì)胞數(shù)百分比，<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。兩個(gè)定量數(shù)字相加，總分值<4分為陰性，≥4分為陽性。

細(xì)胞凋亡陽性結(jié)果判定：利用TUNEL法，腫瘤細(xì)胞核被染為棕黃色，用光學(xué)顯微鏡，計(jì)數(shù)每1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的個(gè)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。需排除嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和壞死灶，避免造成假陽性結(jié)果〔2〕。凋亡細(xì)胞指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、直線相關(guān)性分析。

2結(jié)果

2.1c-myc表達(dá)與臨床病理的關(guān)系c-myc經(jīng)免疫組化后，細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞核被染成棕黃色，肺癌組織陽性率為60.0%(30/50)，正常組織陽性率為20%(4/20)，兩者差異顯著(χ2=9.150，P=0.002)，但c-myc在癌組織的染色均深于正常組織。結(jié)果顯示，c-myc在腺癌中的表達(dá)率高于在鱗癌中(χ2=5.918，P=0.015)，在高分化組織的陽性表達(dá)率高于中分化和低分化(χ2=7.888，P=0.019)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者c-myc陽性率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性率高(χ2=4.327，P=0.038)。TNMⅢ期和Ⅳ期c-myc陽性率高于Ⅰ期和Ⅱ期陽性率(χ2=7.484，P=0.006)。c-myc的表達(dá)與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、腫瘤位置、有無胸腔積液無明顯關(guān)系(P>0.05)，見表1。

表1　c-myc的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征關(guān)系〔 n(%)〕

2.2c-myc與細(xì)胞凋亡直線相關(guān)分析表明，隨著表達(dá)c-myc分值越高，細(xì)胞的凋亡指數(shù)越低，與凋亡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.784,P=0.000)。其中0分AI值9.67±1.15，1～2分AI值為7.25±1.24，3～4分AI值為5.14±0.71，5～6分AI值為3.50±0.48 。

3討論

人類腫瘤(宮頸鱗癌〔3〕、肝癌〔4〕、食管鱗癌〔5〕等)中大多可檢測到c-myc的表達(dá)異常,c-myc原癌基因激活的主要方式是c-myc的擴(kuò)增和過度表達(dá)〔6〕。李雪婷等〔3〕利用原位雜交技術(shù)檢測c-myc mRNA的表達(dá)從CINⅠ-Ⅱ～CINⅢ直至發(fā)展到鱗癌的過程中，陽性率明顯升高，c-myc基因在CIN病變即被激活，持續(xù)存在并逐漸積累于發(fā)展為宮頸鱗癌的整個(gè)癌變過程中。范平明等〔5〕應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)MMP-14和c-myc在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)且有協(xié)同，MMP-14、c-myc的表達(dá)與食管鱗癌細(xì)胞患者的預(yù)后有關(guān)。

項(xiàng)鋒鋼等〔7〕發(fā)現(xiàn)Bmi-1、c-myc蛋白在NSCLC的陽性表達(dá)率及強(qiáng)度均顯著高于正常肺組織。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示c-myc在NSCLC發(fā)生發(fā)展中起作用，上調(diào)c-myc的表達(dá)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增生、浸潤，導(dǎo)致NSCLC的發(fā)生，c-myc可能成為肺癌早期診斷標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)。Nakashima等〔8〕發(fā)現(xiàn)高Wnt3表達(dá)腫瘤在肺鱗狀細(xì)胞癌比在肺腺癌更高。Wnt3基因表達(dá)與c-myc的表達(dá)和survivin的表達(dá)明顯相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示c-myc可能成為肺腺癌早期診斷標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)〔9〕。王革平等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)高分化癌中c-myc 的表達(dá)低于中低分化癌，分化從高到低c-myc表達(dá)呈拋物線狀趨勢。項(xiàng)鋒鋼等〔7〕也發(fā)現(xiàn)c-myc的陽性表達(dá)與肺癌的分化程度有關(guān)，分化程度越高，陽性率越高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示c-myc上調(diào)可能與腫瘤的惡性程度有關(guān)，對其進(jìn)行檢測有可能提示NSCLC惡性程度。但賴習(xí)華等〔9〕、簡麗萍等〔11〕、辛彩霞等〔12〕發(fā)現(xiàn)c-myc的表達(dá)與組織分化程度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些文獻(xiàn)研究結(jié)果不一致的原因可能與樣本組織高中低分化程度、樣本數(shù)量等因素有關(guān)。項(xiàng)鋒鋼等〔7〕發(fā)現(xiàn)c-myc的陽性表達(dá)與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。趙云霞等〔13〕發(fā)現(xiàn)c-myc表達(dá)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示c-myc表達(dá)上調(diào)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。項(xiàng)鋒鋼等〔7〕研究結(jié)果c-myc陽性表達(dá)與肺癌的TNM分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示c-my與NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后有關(guān)。另外c-myc基因上調(diào)或增加導(dǎo)致凋亡減少，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，下調(diào)或抑制該基因可能抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。

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〔2014-02-14修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)