李學(xué)龍，楊寶田

(沈陽師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽110034)

東北粗皮蛙(Rugosa emeljanovi)為蛙科(Ranidae)，粗皮蛙屬(Rugosa)動物［1］。其模式標(biāo)本產(chǎn)地在黑龍江省尚志市一面坡鎮(zhèn)［2］，分布范圍主要位于東北亞地區(qū)。已知在國內(nèi)分布于東北三省的東部地區(qū):吉林省包括吉林市、集安市、撫松縣和榆樹市;黑龍江省見于尚志市;遼寧省分布相對較廣，在丹東、桓仁、清源、本溪、莊河、寬甸、大連以及岫巖等市縣均有棲息。在國外主要分布于俄羅斯遠東和朝鮮半島。東北粗皮蛙主要棲息在水田、流水緩慢的河流和山間溪流及水渠岸邊，白天隱藏于草叢中、溪流附近的石縫或石塊下及水底的水草間，夜晚在水田邊、水域岸邊捕食［1］。

近年來，許多學(xué)者對粗皮蛙的分類地位看法不一。粗皮蛙原隸屬于蛙科(Ranidae)蛙屬(Rana)，東北粗皮蛙曾被認為是日本粗皮蛙(Rana rugosa)的同物異名［3］或其亞種(R.rugosa emeljanovi)［4］，1990年費梁等以日本粗皮蛙Rana rugosa為模式物種建立了粗皮蛙屬(Rugosa)，并將中國東北地區(qū)樣本恢復(fù)為有效種，學(xué)名定為Rugosa emeljanowi。而Dubois(1992)把粗皮蛙屬Rugosa作為蛙屬Rana的亞屬，即粗皮蛙亞屬Rana(Rugosa)［5］?；诜肿酉到y(tǒng)發(fā)育分析，F(xiàn)rost et al.(2014)仍將粗皮蛙合并于腺蛙屬 Glandirana 中［6］。

國內(nèi)對于粗皮蛙的研究報道相對較少。趙文閣等(2004)［7］曾對遼寧產(chǎn)粗皮蛙的染色體組型做了研究，吳貫夫和趙蕙(2006)［8］詳細描述了我國產(chǎn)粗皮蛙骨骼系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。兩棲動物性別決定的復(fù)雜性和特殊性使得很多學(xué)者將目標(biāo)集中于這一領(lǐng)域的研究。Miura(2007)［9］研究發(fā)現(xiàn)，粗皮蛙具有XX/XY和ZZ/ZW兩種性別決定系統(tǒng)，而對性別分化及決定起作用的基因較多，如常染色體基因DMRT1、FOXL2、SOX9等，性染色體基因DAX1、SF1、SOX3等，并且這些基因的作用機制也較為復(fù)雜［10－16］。有關(guān)粗皮蛙遺傳多樣性研究多為韓國學(xué)者報道。Park(1990)［17］和Lee et al.(1991)［18］先后利用染色體核型分析探討了東北粗皮蛙的遺傳多態(tài)性。隨后，Lee et al.(1992)［19］又應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism)標(biāo)記技術(shù)分析了粗皮蛙線粒體DNA在不同種群間的長度變異。DNA測序技術(shù)的普及和應(yīng)用，使得研究者能夠從最基本的DNA序列組成和基因結(jié)構(gòu)分析來探討生物的遺傳變異。韓國學(xué)者Lee et al.(1999)［20］通過對線粒體細胞色素b基因(Cytb)部分核酸序列分析，探討了韓國分布的東北粗皮蛙不同種群遺傳多樣性。本文通過對中國東北分布的粗皮蛙線粒體Cytb基因和控制區(qū)(D－loop)部分DNA序列進行研究，探討其遺傳多態(tài)性和種群遺傳結(jié)構(gòu)，以期為保護生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

野外采集東北粗皮蛙樣本29個，分別來自于吉林吉安(Re01～Re04)、遼寧蓋州(Re05、Re06)、海城(Re07 ～ Re09)、新賓(Re10 ～ Re12)、莊河(Re13 ～ Re17)、岫巖(Re18 ～ Re20)、桓仁(Re21 ～ Re25)、寬甸(Re26)和丹東(Re27～Re29)9個地理種群(圖1)。粗皮蛙樣本取后肢趾尖后放生，指尖組織置于95%乙醇中固定并存放于－25℃冷藏箱中保存待用。

1.2 基因組DNA的提取、PCR擴增及測序

用AXYGEN試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司)提取基因組DNA，具體操作方法按照試劑盒說明書進行。提取的DNA存放在－20℃冰箱內(nèi)保存待用。線粒體控制區(qū)DNA擴增所用引物為本實驗室設(shè)計篩選，其序列為Lrug:5’－AGCTCTGACCTTCGCTTGAT－3’;Hrug:5’－CCAGGAGCCCTCGTTATCAT－3’。線粒體Cytb基因擴增所用引物為 L14850:TCTCATCCTGATGAAACTTTGGCTC［20］，Cytbs:TAAATCTCACCCCCTCCTCAA［21］。引物由北京華大基因有限公司合成。每個PCR反應(yīng)總體積為25μl，包括18.9μl超純水、2.5μl Buffer緩沖液(含 MgCl2)、2.0μl 10mmol·L－1dNTP、1.0 μl 10mmol·L－1引物(上下游引物各0.5μl)、0.125 μl Taq DNA 聚合酶。在ABI2720 PCR儀上進行擴增，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min后進入以下循環(huán):94℃變性30 s、50℃退火50 s、72℃延伸1 min共40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京華大基因有限公司測序。

圖1 東北粗皮蛙樣本采集地點

1.3 序列分析

所測得序列經(jīng)Blast搜索驗證其可靠性，利用Clustal X軟件［22］對DNA序列進行多重比對并輔以手工編輯校正。用MEGA6.0［23］軟件分析不同序列間的堿基組成和變異位點，并計算基于Kimura雙參數(shù)模型的遺傳距離。用 DNAsp5.0［24］計算單倍型多態(tài)性(Hapltype diversity，H)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)等遺傳多樣性指數(shù)。利用Arlequin3.1［25］軟件進行遺傳結(jié)構(gòu)分析和分子變異分析(Analysis of molecular variance，AMOVA)。單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖用 TCS 1.20［26］軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 線粒體DNA控制區(qū)序列堿基組成和變異位點。

東北粗皮蛙線粒體DNA控制區(qū)經(jīng)PCR擴增后得到長度為587bp的片段，經(jīng)Blast比對分析確定為東北粗皮蛙線粒體DNA控制區(qū)部分序列。在該序列中，A、T、G與C四種核苷酸的平均含量分別為31.7%、33.6%、12.9%和21.8%，A和T的含量為65.3%，明顯高于G和C的含量。29個樣本序列存在6個變異位點，共定義8個單倍型，單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)3個遺傳多樣性參數(shù)分別為0.525、0.001、0.749。其中Hap1為9個地理種群共享單倍型，Hap2為吉林吉安種群與遼寧岫巖種群共享單倍型。單倍型和變異位點如表1所示。圖2(A)是依據(jù)單倍型間核苷酸差異構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，可以看出東北粗皮蛙線粒體控制區(qū)序列8個單倍型沒有形成分支結(jié)構(gòu)，各單倍型間僅有1～3步突變。

表1 東北粗皮蛙線粒體DNA控制區(qū)變異位點分布

圖2 線粒體DNA控制區(qū)序列(A)和Cytb基因(B)單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.2 線粒體Cytb基因堿基組成和變異位點

東北粗皮蛙線粒體Cytb基因PCR擴增后得到長度為895bp的片段，序列經(jīng)Blast同源性比對分析確定為東北粗皮蛙線粒體Cytb基因部分片段。在該片段中，A、T、G與C四種核苷酸的平均含量分別為23.6%、28.2%、14.0%和34.2%，A和T的含量為53.8%，略高于G和C的含量。在29個樣本序列中發(fā)現(xiàn)8個變異位點，共定義7個單倍型，單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)分別為0.418、0.001、0.667。其中Hap1為9個地理種群共享單倍型，Hap7為吉林吉安種群與遼寧莊河種群共享單倍型。單倍型和變異位點如表2所示。圖2(B)是Cytb基因片段單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。各單倍型間核苷酸突變步驟在1～5之間，Hap2與Hap3間最多。

表2 東北粗皮蛙線粒體Cytb基因變異位點分布

2.3 線粒體DNA序列合并數(shù)據(jù)分析

將所測線粒體控制區(qū)和Cytb基因序列合并得到長度為1482bp序列。合并序列共定義14個單倍型，單倍型多樣性0.704，核苷酸多樣性0.001，平均核苷酸差異數(shù)為1.438。基于Kimura雙參數(shù)模型的單倍型間的遺傳距離在0.000～0.005之間，平均為0.001，對定義的9個種群分析，種群間遺傳距離為0.000～0.002。分子變異分析(AMOVA)結(jié)果(表3)，種群內(nèi)變異占全部遺傳變異的98.13%，也就是說，遺傳變異幾乎全部來源于群體內(nèi)個體間，群體間沒有遺傳分化。遺傳分化指數(shù)FST為0.0187(P＞0.05)。

表3 基于線粒體DNA合并數(shù)據(jù)對東北粗皮蛙的AMOVA分析

3 討論

本研究通過線粒體控制區(qū)和Cytb基因序列分析，探討了9個東北粗皮蛙種群的遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)。從各項遺傳參數(shù)可以看出，東北粗皮蛙種群的遺傳多樣性很低，種群間無遺傳分化。

東北粗皮蛙在中國主要分布于東北東部山區(qū)，通過野外實地調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在長白山及其南部山地丘陵較為常見，且種群數(shù)量也相對較多。國外主要分布在朝鮮半島及俄羅斯遠東邊疆區(qū)。韓國學(xué)者Lee et al.(1999)［20］利用線粒體Cytb基因?qū)|北粗皮蛙種群遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，韓國東北粗皮蛙可以分成2個分離的支系(A和B)，A貫穿于整個韓國地域，B則集中于韓國東南的中部地區(qū)，而在韓國Tonghae種群中2個支系類型都有發(fā)現(xiàn)。A支系的6個種群Cytb序列差異為0～0.8%，B支系的4個種群為0～1.0%，但2個支系間的序列差異則達到5.4～6.6%，基于Kimura雙參數(shù)的A與B支系遺傳距離是6.7%。Yang et al.［27］利用淀粉凝膠電泳方法分析了東北粗皮蛙的17個等位酶和蛋白質(zhì)，結(jié)果認為韓國種群的遺傳分化程度適中。本研究中，線粒體控制區(qū)和Cytb基因合并序列分析，核苷酸多樣性僅為0.001，平均核苷酸差異數(shù)為1.438，9個種群間的遺傳距離為0～0.2%，低于韓國2個支系內(nèi)種群間的變異水平。分子變異分析結(jié)果，東北粗皮蛙種群遺傳變異幾乎全部來源于群體內(nèi)個體間，群體間沒有遺傳分化(FST=0.01868)，明顯低于韓國種群。在其他蛙科物種的研究中［28－30］也有類似的結(jié)果。

本研究所采集東北粗皮蛙樣本均來自長白山南部山地丘陵及其余脈——千山山地，這些地區(qū)地形地貌相近，同屬東北東部山地針闊葉混交林亞區(qū)域，河流密布貫通且少有高山分割。東北粗皮蛙生活在河流水域附近，受精卵、蝌蚪及成體借河水溪流遷移，這可能是造成中國分部東北粗皮蛙遺傳多樣性低、種群間無遺傳分化的主要原因。

動物的遺傳多樣性體現(xiàn)在群體、個體、組織、細胞以及分子水平。在自然界，由于個體生命的有限性，其特定分布格局的群體才是進化的基本單位。因而，遺傳多樣性不僅包括遺傳變異高低，也包括遺傳變異在群體間的分布格局，即種群遺傳結(jié)構(gòu)。一個物種的進化潛力和抵御不良環(huán)境的能力取決于種內(nèi)遺傳變異的大小，更有賴于群體遺傳結(jié)構(gòu)［31］。東北粗皮蛙在中國僅分布于東北地區(qū)東部長白山脈區(qū)域，已被列入《國家保護的有益的或有重要經(jīng)濟、科研價值的陸生野生動物名錄》種類。本研究表明，東北粗皮蛙的遺傳多樣性低，種群間無遺傳分化。鑒于此，對東北粗皮蛙野生種群的保護應(yīng)當(dāng)引起足夠重視，特別是對其食物、水及隱蔽所等棲息地環(huán)境的保護，同時，在遺傳、生態(tài)以及保護生物學(xué)等領(lǐng)域開展深入的研究。

4 結(jié)論

(1)東北粗皮蛙種群遺傳多樣性低，種群間無遺傳結(jié)構(gòu)。

(2)應(yīng)加強對東北粗皮蛙野生種群的保護。

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