李壽青，王金城，趙龍彪，申華素，陶玥江，蔚冬冬

(河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院東區(qū)麻醉科，河北石家莊050035)

烏司他丁對急性心肌梗死大鼠心臟的保護作用

李壽青，王金城*，趙龍彪，申華素，陶玥江，蔚冬冬

(河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院東區(qū)麻醉科，河北石家莊050035)

目的探討烏司他丁對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡和心功能的影響，為術中急性心肌梗死的治療用藥提供理論依據(jù)。方法 健康雄性SD大鼠30只，隨機分為假手術組、對照組和烏司他丁組，每組10只。對照組和烏司他丁組大鼠開胸心室壁穿線結扎左冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型，假手術組大鼠只開胸并在心室壁內穿線不結扎左冠狀動脈前降支。對照組大鼠在術后給予腹腔注射生理鹽水1 mL，烏司他丁組大鼠在術后給予腹腔注射烏司他丁8萬U/kg，假手術組大鼠在術后給予腹腔注射生理鹽水1 m L，3組療程均為3 d。各組大鼠在術后均給予青霉素40萬U/kg肌肉注射預防感染。每組隨機選5只于術后1周取結扎部位以下心室細胞用流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率。其余5只大鼠于術后4周做心功能檢測，檢測左心室收縮壓力最大變化率、左心室舒張壓力最大變化率和心率。結果與假手術組比較，烏司他丁組和對照組心肌細胞凋亡率均明顯增加(P＜0.01)，收縮壓力最大變化率和舒張壓力最大變化率明顯降低(P＜0.01)，心率明顯升高(P＜0.01)。烏司他丁組心肌細胞凋亡率較對照組明顯降低(P＜0.01)。烏司他丁組收縮壓力最大變化率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，舒張壓力最大變化率與對照組比較明顯升高(P＜0.01)，心率與對照組比較明顯降低(P＜0.01)。結論烏司他丁對急性心肌梗死大鼠心臟有一定保護作用，可作為術中治療急性心肌梗死、保護心臟功能的用藥。

心肌梗死;烏司他丁;大鼠

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一種嚴重影響人類健康的疾病，可使心臟功能大大降低，是心血管疾病中一個重要的致死性疾病。烏司他丁是從人尿液中提取的蛋白酶抑制劑，可抑制多種酶的活性，對溶酶體有膜穩(wěn)定性的作用，可減少心肌抑制因子的生成，通過抑制炎性介質的釋放抑制炎癥反應。在臨床上烏司他丁最早用于急性胰腺炎的治療，并被證實是安全有效的［1］。另外，烏司他丁還可以通過其膜穩(wěn)定性作用抑制休克時溶酶體破壞釋放水解酶對重要臟器產生的損害;烏司他丁的抗炎癥、抗應激反應作用已被臨床上用于保護重要臟器和對抗手術刺激。AMI患者術中應用烏司他丁對心臟的保護作用尚未見報道。本研究選用烏司他丁干預治療AMI大鼠，探討烏司他丁對AMI后心臟的作用，旨在為臨床用藥提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性SD大鼠30只(購于河北省實驗動物中心)，體質量200～240 g，隨機分為假手術組、對照組和烏司他丁組，每組10只。

1.2 心肌梗死模型制備［2］麻醉:腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉動物，實驗中可追加0.1～0.3 mL。插入氣管插管，連接小動物呼吸機(DW-3000，淮北正華生物儀器設備有限公司生產)，調節(jié)呼吸頻率為90次/min，調整潮氣量保證分鐘通氣量達到1 mL/g。備皮后消毒，暴露心臟，用事先準備的浸泡在生理鹽水中的帶針6.0無損傷絲線穿過心室壁并結扎左冠狀動脈前降支(假手術組不結扎左冠狀動脈前降支)。結扎成功后結扎部位以下心肌顏色變淺，證明結扎成功。體外結扎過程需快速不宜超過45 s。然后用0號縫合線逐層縫合關閉胸腔，關閉胸腔前預留另一套管針軟管，在閉關胸腔后用注射器抽出胸腔中的空氣以減小對大鼠生理狀態(tài)的影響，降低大鼠術后病死率。術畢大鼠后肢肌肉注射40萬U/kg青霉素預防感染。待大鼠恢復自主呼吸(沒有自主呼吸的大鼠可人工按壓胸部3～5次即可恢復)后，停用呼吸機，拔出氣管導管。

1.3 處理方法 假手術組在術后給予腹腔注射生理鹽水1 mL，對照組在術后給予腹腔注射生理鹽水1 mL，烏司他丁組在術后給予腹腔注射烏司他丁(批號031208174，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)80 000 U/kg，療程均為3 d。

1.4 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡 術后1周大鼠稱質量，麻醉后，由下腔靜脈注射伊文藍3 mL，迅速取大鼠心臟，放入生理鹽水中沖洗，盡量洗凈心腔中的血液和伊文藍。大鼠心臟可見被伊文藍染成藍色的區(qū)域為正常心肌組織和未被染色的區(qū)域為梗死區(qū)心肌組織，剪下沒有被伊文藍染色的梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)組織。將剪下的組織放入扎在小燒杯上的100目尼龍網(wǎng)上用剪刀將組織剪碎。剪到約1 mm3大小，然后用眼科鑷子輕輕搓已經剪碎的組織塊，邊搓邊加稀釋的胎牛血清直到組織搓完，再用胎牛血清沖洗尼龍網(wǎng)，盡量沖凈尼龍網(wǎng)以得到更多的心肌細胞。收集小燒杯中的細胞懸液，加入到試管中，再將裝有細胞懸液的試管上放置離心機中離心沉淀，以1 000 r/min離心3～5 min。待離心完畢后去掉上清液，用胎牛血清沖洗吹打混勻，再將試管放置離心機上以500～800 r/min離心2～3 min。重復此操作3遍，短時離心沉淀可去除細胞碎片。按凋亡試劑盒(聯(lián)科生物公司Annexin V/PI)的說明操作，上機做流式細胞凋亡檢測。

1.5 大鼠心功能的測定［3］術后4周大鼠稱質量，按0.3 m L/100 g劑量給予腹腔注射10%水合氯醛麻醉，充分暴露大鼠頸部，行頸動脈置管，連接多導生理記錄儀(Powerlab8/30，澳大利亞埃德儀器公司)，待系統(tǒng)自動記錄2～3 min后停止測量，通過運行Chart軟件分析采集數(shù)據(jù)。做完心功能的大鼠，迅速取出心臟固定，梗死及邊緣區(qū)行HE染色。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 術后1周大鼠心肌凋亡率比較 與假手術組比較，烏司他丁組和對照組心肌細胞凋亡率均明顯增加(P＜0.01);烏司他丁組心肌細胞凋亡率較對照組明顯降低(P＜0.01)。見表1。

2.2 術后4周大鼠心臟功能比較 與假手術組比較，烏司他丁組和對照組收縮壓力最大變化率和舒張壓力最大變化率明顯降低(P＜0.01)，心率明顯升高(P＜0.01)。烏司他丁組收縮壓力最大變化率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，舒張壓力最大變化率與對照組比較明顯升高(P＜0.01)，心率與對照組比較明顯降低(P＜0.01)。見表1。

2.3 鏡下觀察 結扎線以下大鼠心肌梗死及邊緣區(qū)心肌組織切片鏡下觀察可見假手術組大鼠心肌細胞無明顯炎性細胞浸潤(圖1)，對照組和烏司他丁組大鼠心肌細胞則有明顯炎性細胞浸潤(圖2，3)，但烏司他丁組大鼠梗死及邊緣區(qū)炎性細胞浸潤較對照組明顯減少。

表1 烏司他丁對AMI模型大鼠細胞凋亡率及心臟功能的影響(n=5，±s)

表1 烏司他丁對AMI模型大鼠細胞凋亡率及心臟功能的影響(n=5，±s)

*P＜0.01與假手術組比較 #P＜0.01與對照組比較(q檢驗)

組別 細胞凋亡率(%) 收縮壓力最大變化率(mmHg/s) 舒張壓力最大變化率(mmHg/s) 心率(次/min)假手術組 4.48±2.17 6 766.47±1 184.47 6 581.62±814.69341±21對照組 43.23±4.40* 3 558.41±349.08* 3 380.85±249.90* 392±15*烏司他丁組 25.40±1.91*# 4 204.25±602.16* 4 169.17±711.54*# 360±12*#F0.000 0.000 0.000 0.000 407.172 45.760 67.695 24.605P

3 討 論

本研究中選用烏司他丁作用于AMI大鼠，探討烏司他丁對于AMI大鼠心肌細胞凋亡及心功能的影響。廣泛應用于生物醫(yī)學基礎領域的流式細胞術是經熒光色素染色的細胞或細胞結構在高速流動狀態(tài)下經高能激光照射，分析其發(fā)射熒光的強度和散射光，進而分析細胞功能狀態(tài)，對其進行定量定性檢測。本研究中用于分析梗死及邊緣區(qū)心肌細胞的凋亡。

本研究結果顯示，烏司他丁組大鼠與對照組大鼠比較心肌細胞凋亡率明顯減少，且心功能也有了一定的提高。鏡下觀察大鼠梗死區(qū)及邊緣區(qū)炎性細胞浸潤明顯減少。而這種心肌周圍炎性細胞浸潤的減少可能是烏司他丁發(fā)揮保護心肌細胞減少其凋亡進而提高心功能一個重要因素。烏司他丁發(fā)揮其保護心臟作用的可能機制如下:心肌梗死后可能會由炎細胞浸潤、自由氧、機械應力、神經激素系統(tǒng)等引發(fā)細胞的凋亡。在烏司他丁對器官保護作用的研究中［4］發(fā)現(xiàn)烏司他丁可減少腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)髓過氧化物酶的產生。烏司他丁是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出的一種酸性糖蛋白水解酶抑制劑，相對分子質量為67 000，含有143個氨基酸，有2個不完全重疊的活性功能區(qū)，可同時抑制多種蛋白酶。此外，烏司他丁還作為膜穩(wěn)定劑具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體膜和線粒體膜的破壞，從而抑制溶酶體酶的釋放而保護組織。其還可以減少心肌抑制因子的分泌，改善微循環(huán)抗休克，減輕炎癥反應，清除自由氧等功效。烏司他丁最早應用于臨床是針對急性胰腺炎的治療，在大量研究和臨床探索中其在對抗手術的刺激、急性循環(huán)衰竭的治療、器官缺血再灌注損傷的治療等方面均有較顯著的效果。這與在國內外多項研究［5-6］中報道的烏司他丁對心臟的保護作用結果相一致。烏司他丁通過其膜穩(wěn)定性作用發(fā)揮穩(wěn)定中性粒細胞膜作用，抑制了其毒性自由氧的釋放。對線粒體膜的穩(wěn)定作用也有效抑制了細胞凋亡和缺血后能量代謝的紊亂［7］。TNF-α、活性氧是增加心肌細胞凋亡的因素［8］，而 TNF-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8和活性氧成分降低可通過影響凋亡基因的調控使凋亡抑制基因Bcl-2上調，同時下調促進凋亡基因Bax［9］，使心肌細胞凋亡減少。TNF-α、IL-6、IL-8等炎性趨化因子水平的降低使中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等炎性細胞向梗死區(qū)的轉移，降低血管通透性，減少梗死區(qū)局部間質炎癥水腫，梗死區(qū)周圍因烏司他丁作用而降低的活性氧均可改善梗死區(qū)周圍微循環(huán)，改善心肌順應性，保護周圍正常心肌細胞。

綜上所述，烏司他丁抑制心肌抑制因子釋放的功能也降低了心肌抑制因子對心肌收縮力的不良作用，進而改善心功能保護心臟。烏司他丁可以降低AMI后心肌細胞的凋亡，保護心臟功能。本研究結果提示烏司他丁可以作為術中AMI治療保護心臟的臨床用藥。(本文圖見封三)

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(本文編輯:趙麗潔)

R542.22

B

1007-3205(2015)02-0211-03

2014-05-15;

2014-11-20

李壽青(1987-)，女，云南昭通人，河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院醫(yī)學碩士研究生，從事臨床麻醉學研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.034