牛林紅，董會臺，楊麗莉，宋 波，張 榮，牛玉杰*

(1.河北省石家莊市職業(yè)病防治院健康檢查科，河北石家莊050031;2.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，河北石家莊050017)

不同粒徑納米二氧化鈦對小鼠抗氧化能力的損傷作用

牛林紅1，董會臺1，楊麗莉1，宋 波2，張 榮2，牛玉杰2*

(1.河北省石家莊市職業(yè)病防治院健康檢查科，河北石家莊050031;2.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，河北石家莊050017)

目的觀察50 nm和120 nm二氧化鈦(titanium dioxide，TiO2)對小鼠抗氧化能力的損傷作用。方法 48只健康雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為對照組(四蒸水)、50 nm TiO2組(5 g/kg)、120 nm TiO2組(5 g/kg)，灌胃染毒7 d，測定血清、肝、腎、皮層、海馬組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathine peroxidase，GSH-Px)活性。結(jié)果50 nm TiO2和120 nm TiO2染毒后，小鼠各組織MDA含量除120 nm TiO2組皮層外，均明顯高于對照組(P＜0.05);SOD活性除120 nm TiO2組血清外，均明顯低于對照組(P＜0.05或＜0.01);而GSH-Px活性均明顯低于對照組(P＜0.05或＜0.01);50 nm TiO2組肝臟、腎臟、海馬中的GSH-Px活性、皮層和海馬中的SOD活性明顯低于120 nm TiO2組(P＜0.05)。結(jié)論50 nm TiO2和120 nm TiO2經(jīng)口急性染毒后可使小鼠肝臟、腎臟、皮層和海馬細(xì)胞中MDA含量增加、SOD和GSH-Px活性降低，使小鼠抗氧化能力受損，但尚不能得出隨TiO2粒徑減小其損害作用增加的結(jié)論。

二氧化鈦;毒性實(shí)驗(yàn);小鼠

納米顆粒是指直徑＜100 nm并出現(xiàn)納米效應(yīng)的顆粒。納米二氧化鈦(nanoparticle titanium dioxide，Nano-TiO2)因其具有優(yōu)越的熱磁、光敏感性、表面穩(wěn)定性、擴(kuò)散和力學(xué)等性能，廣泛應(yīng)用于涂料、污水凈化、空氣凈化、化妝品、食品包裝及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域［1］。在生產(chǎn)和使用過程中Nano-TiO2可能進(jìn)入人體危害人體健康，因而對其安全性評價及健康損害效應(yīng)越來越受到關(guān)注。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2具有遺傳毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性、呼吸毒性等［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)Nano-TiO2可使 HepG2細(xì)胞受損，損害細(xì)胞的抗氧化功能［4］;小鼠消化道暴露Nano-TiO2后，可使小鼠肝臟、腎臟、腦細(xì)胞中活性氧生成增加［5］。有研究顯示，食品級二氧化鈦(titanium dioxide，TiO2)原料中有36%的顆粒處于納米尺度［6］，從口香糖中提取的TiO2，93%的顆粒直徑處于納米尺度［7］。說明Nano-TiO2存在著經(jīng)消化道進(jìn)入體內(nèi)的可能，目前Nano-TiO2的毒性研究多采用呼吸染毒，經(jīng)口毒性研究相對較少。因此，本研究選用50 nm和非常接近納米級別的120 nm TiO2為實(shí)驗(yàn)材料，采用消化道染毒方法，觀察急性染毒后對小鼠肝、腎、腦等組織抗氧化能力的損傷作用，旨在為進(jìn)一步揭示氧化應(yīng)激在Nano-TiO2毒性機(jī)制中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TiO2購自浙江弘晟材料科技股份有限公司，分為50、120 nm 2種規(guī)格，X線衍射測定顯示TiO2晶型為金紅石，純度分別為98.0%和99.0%。丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathine peroxidase，GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所。

1.2 動物分組和處理 健康雄性昆明種小鼠48只(河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號:醫(yī)動字第703046號)，體質(zhì)量17～22 g，隨機(jī)分為對照組(四蒸水)、50 nm TiO2組(劑量5 g/kg)、120 nm TiO2組(劑量5 g/kg)，每組16只。染毒前，動物隔夜禁食，按照每組劑量，將Nano-TiO2溶于四蒸水中，配制成125 g/L的懸濁液，充分混勻。灌胃前用超聲波清洗器37℃超聲30 min，按0.1 m L/10 g體質(zhì)量的劑量，1 min內(nèi)連續(xù)灌胃達(dá)到染毒劑量，2 h后給予食物，觀察1周后進(jìn)行相應(yīng)項(xiàng)目的檢測。

1.3 MDA含量和SOD、GSH-Px活性的測定 染毒后第8天，每組取8只小鼠，迅速收集股動脈血液約1 mL，立即以3 000 r/min離心15 min，將上清移到新EP管中，-80℃保存。將小鼠斷髓處死，在冰盤上迅速剝離肝、腎和腦組織(腦組織分離出皮層和海馬)。分別在冰凍生理鹽水中漂洗，去掉表面血跡，濾紙拭干，稱質(zhì)量，加入一定量冰的生理鹽水，用玻璃勻漿器在0～4℃下制成 10%的組織勻漿，4 000 r/min離心15 min，取上清備用;用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行蛋白質(zhì)測定。各組血清、肝、腎、皮層、海馬組織中MDA含量、SOD和GSH-Px活性的測定均按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠的一般狀況 實(shí)驗(yàn)過程中，各組實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活，一般狀況良好，飲水量、進(jìn)食量未見明顯改變。

2.2 血清中MDA含量和SOD、GSH-Px活性的變化

50 nm TiO2組和120 nm TiO2組小鼠血清中MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，GSH-Px活性明顯降低(P＜0.05);50 nm TiO2組小鼠SOD活性與對照組相比明顯降低(P＜0.05)，而120 nm TiO2組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明Nano-TiO2可對血液系統(tǒng)的抗氧化功能產(chǎn)生損傷。見表1。

表1 Nano-TiO2對血清MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

表1 Nano-TiO2對血清MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較(q檢驗(yàn))

組別 MDA (nmol/m L) SOD (U/m L) GSH-Px (U/mL) 6.50±1.18 126.20±11.42 554.27±31.54 50 nm組 9.87±3.15* 104.97±10.65*512.93±7.21*120 nm組 7.97±1.10* 116.03±5.14 524.50±23.71*F對照組＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 5.470 10.012 6.785P

2.3 肝臟MDA含量和SOD、GSH-Px活性的變化

50 nm TiO2組和120 nm TiO2組小鼠肝組織勻漿中MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，SOD和GSH-Px活性與對照組相比則顯著降低(P＜0.05或＜0.01);且50 nm TiO2組GSH-Px活性顯著低于120 nm TiO2組(P＜0.05)。說明Nano-TiO2可以導(dǎo)致肝組織抗氧化功能損傷。見表2。

表2 Nano-TiO2對肝臟MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

表2 Nano-TiO2對肝臟MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.01與對照組比較 △P＜0.05與50 nm組比較(q檢驗(yàn))

?

2.4 腎臟MDA含量和SOD、GSH-Px活性的變化

50 nm TiO2組和120 nm TiO2組，小鼠腎臟中MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，SOD和GSH-Px活性與對照組相比則顯著降低(P＜0.05或＜0.01);且50 nm TiO2組GSH-Px活性顯著低于120 nm TiO2組(P＜0.05)。說明Nano-TiO2可以導(dǎo)致腎臟抗氧化功能損傷。見表3。

表3 Nano-TiO2對腎臟MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

表3 Nano-TiO2對腎臟MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.01與對照組比較 △P＜0.05與50 nm組比較(q檢驗(yàn))

?

2.5 腦組織MDA含量和SOD、GSH-Px活性的變化

50 nm TiO2組小鼠皮層內(nèi)MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，120 nm TiO2組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;50 nm TiO2和120 nm TiO2組皮層SOD和GSH-Px活性與對照組相比均顯著降低(P＜0.05或＜0.01)，且50 nm TiO2組SOD活性顯著低于120 nm組(P＜0.05)。見表4。

50 nm TiO2組和120 nm TiO2組小鼠腦海馬內(nèi)MDA含量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，而SOD和GSH-Px活性與對照組相比顯著降低(P＜0.05或＜0.01)，且50 nm組SOD和GSH-Px活性均顯著低于120 nm TiO2組(P＜0.05)。見表5。

表4 Nano-TiO2對皮層MDA、SOD和GSH-Px的影響(n=8，±s)

表4 Nano-TiO2對皮層MDA、SOD和GSH-Px的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.01與對照組比較 △P＜0.05與50 nm組比較(q檢驗(yàn))

?

表5 Nano-TiO2對海馬MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

表5 Nano-TiO2對海馬MDA、SOD和GSH-Px活性的影響(n=8，±s)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.01與對照組比較 △P＜0.05與50 nm組比較(q檢驗(yàn))

組別 MDA (nmol/mg prot) SOD (U/mg prot) GSH-Px (U/mg prot) 17.83±1.36 258.09±11.58 114.85±27.21 50 nm組 21.20±0.92* 176.37±15.23# 79.50±10.84#120 nm組 20.57±1.76*211.30±24.04＊△ 93.58±13.61＊△F對照組＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 13.298 42.745 7.287P

3 討 論

正常情況下，機(jī)體內(nèi)部存在氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡。當(dāng)機(jī)體受到外界有害因素作用時，可通過各種途徑導(dǎo)致自身的抗氧化系統(tǒng)受損，此時系統(tǒng)平衡被打破，機(jī)體內(nèi)部細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起多種損害。MDA是機(jī)體在清除自由基過程中發(fā)生脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，它的含量反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的速率及強(qiáng)度，也間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊損傷的程度;SOD是一種活性物質(zhì)，可消除機(jī)體在新陳代謝過程中所產(chǎn)生的自由基等有害物質(zhì)，機(jī)體受到氧自由基攻擊必然會導(dǎo)致過氧化物增多進(jìn)而消耗過量SOD;GSH-Px主要在肝臟內(nèi)部合成，可與毒物分子及其代謝產(chǎn)物反應(yīng)，降低毒物毒性，并通過氧化還原反應(yīng)降低毒物過氧化能力。通過測定上述指標(biāo)可以較好地反映Nano-TiO2染毒后小鼠氧化應(yīng)激所處的狀態(tài)和抗氧化能力的強(qiáng)弱。

活性氧的生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)是納米材料引起多種生物毒性效應(yīng)的主要方式，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2導(dǎo)致的細(xì)胞毒性、心臟毒性、DNA損傷等與活性氧水平升高、抗氧化功能受損有關(guān)［3-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2可以使大鼠血清、肝、腎MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低［8］; Wang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，80和155 nm TiO2灌胃染毒后可使海馬神經(jīng)元出現(xiàn)空泡;＜25 nm TiO2使大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的病理改變，如染色質(zhì)溶解、核固縮、細(xì)胞密度降低等［10］;體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nano-TiO2對腦膠質(zhì)細(xì)胞有毒性作用［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2消化道染毒后小鼠血清、肝、腎、皮層、海馬組織中MDA含量升高，SOD和GSH-Px活性降低。與上述研究結(jié)果一致。我們以前的研究［12］發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2處理后小鼠肝臟出現(xiàn)細(xì)胞排列紊亂、輕度水腫和空泡變性，腎小管水腫、腎小球腫大，而海馬和皮層的病理改變相對較輕，但也出現(xiàn)神經(jīng)元空泡變性和壞死;結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)的小鼠組織活性氧水平升高［5］。提示Nano-TiO2可能通過氧化損傷作用引起小鼠臟器結(jié)構(gòu)和功能的損害，充分說明氧化應(yīng)激是Nano-TiO2毒性作用機(jī)制的重要組成部分。

關(guān)于納米材料粒徑與其生物學(xué)效應(yīng)之間的關(guān)系，結(jié)論并不一致。常旭紅等［2］發(fā)現(xiàn)，Nano-TiO2暴露在一定程度上能引起大鼠的肺組織抗氧化平衡失調(diào)、病理損傷及超微結(jié)構(gòu)的改變，且同濃度的Nano-TiO2比微米 TiO2氧化損傷更嚴(yán)重;陳苘等［8］用15 nm、25 nm和200 nm TiO2經(jīng)皮膚染毒可引起大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，且粒徑越小引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)越強(qiáng)烈;認(rèn)為TiO2的生物學(xué)效應(yīng)與粒徑大小有關(guān)，粒徑越小其毒性越大。而Warheit等［13］報(bào)道納米和微米尺寸的TiO2顆粒誘發(fā)了同等程度的大鼠肺部炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷;魏紅英等［14］用5、10和40 nm的TiO2觀察了對細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)不同粒徑Nano-TiO2的效應(yīng)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上研究結(jié)果表明，Nano-TiO2粒徑與損傷作用之間的關(guān)系還不十分明確，存在矛盾。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50 nm TiO2組只有肝臟、腎臟、海馬中的GSH-Px活性、皮層和海馬中的SOD活性明顯低于120 nm TiO2組，而其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能得出隨TiO2粒徑減小其毒性作用增加的結(jié)論。但本研究結(jié)果提示，隨著TiO2粒徑的減小，其對小鼠抗氧化能力的損害作用確實(shí)有增加的趨勢，因此，Nano-TiO2粒徑與其損害作用之間的相關(guān)性，尚需進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯:劉斯靜)

R99

B

1007-3205(2015)02-0184-04

2014-12-17;

2015-01-07

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2009001073)

牛林紅(1988-)，女，河北新樂人，河北省石家莊市職業(yè)病防治院醫(yī)師，從事職業(yè)性口腔疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:yjniu@hebmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.023