李寶全，畢建成，安翠平，李延峰，許順江

（1.河北省石家莊市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050011；2.河北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050031）

左旋肉堿在人角膜緣上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)特性

李寶全1，畢建成2，安翠平1，李延峰1，許順江3*

（1.河北省石家莊市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050011；2.河北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050031）

目的檢測(cè)左旋肉堿（L-carnitine，LC）在人角膜緣上皮（human corneal limbal epithelia，HCLE）細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)特性，為進(jìn)一步闡明HCLE細(xì)胞對(duì)LC的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 采用放射攝入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCLE細(xì)胞對(duì)［3H］-L-carnitine的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并利用米氏方程（Michaelis-Menten equation）分析計(jì)算其動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果HCLE細(xì)胞對(duì)LC的轉(zhuǎn)運(yùn)過程具有飽和性和時(shí)間依賴性，并且反應(yīng)體系中需要Na＋的存在。Eadie-Hofstee作圖提示HCLE細(xì)胞存在高親和力和低親合力2個(gè)肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。非標(biāo)記LC和乙?；笮鈮A可競(jìng)爭(zhēng)性抑制［3H］-L-carnitine的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。結(jié)論HCLE細(xì)胞可通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程將淚液中的左旋肉堿攝入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮其生物學(xué)功能。

左旋肉堿；上皮，角膜；胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)

左旋肉堿（L-carnitine，LC）具有促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的β-氧化、轉(zhuǎn)運(yùn)能量、抗氧化與清除自由基等多種重要生理功能［1－3］。人眼淚中可以檢測(cè)到游離及乙?；疞C存在［4］。國(guó)外有研究［5］將LC作為細(xì)胞的滲透壓保護(hù)劑添加于人工淚液中，用來治療干眼癥，可顯著改善患者的臨床癥狀，但其作用機(jī)制尚未闡明，特別是淚液中的LC是通過什么途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)入眼表上皮細(xì)胞內(nèi)及其轉(zhuǎn)運(yùn)特性如何尚未見報(bào)道。本研究采用放射攝入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人角膜緣上皮（Human corneal limbal epithelia，HCLE）細(xì)胞對(duì)［3H］-L-carnitine的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并利用米氏方程分析計(jì)算其動(dòng)力學(xué)參數(shù)，旨在為進(jìn)一步闡明LC在HCLE細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及臨床應(yīng)用LC治療干眼癥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 無血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（keratinocyte serum-free medium，K-SFM）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、DMEM／F12培養(yǎng)基（Invitrogen-Gibco公司，美國(guó)）；［3H］-L-carnitine（GE Healthcare公司，英國(guó)）；其余試劑（Sigma公司，美國(guó)）。CO2培養(yǎng)箱（Heraeus公司，德國(guó)）；LS-6500型多功能液體閃爍計(jì)數(shù)器（貝克曼公司，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究所用HCLE細(xì)胞（美國(guó)波士頓Schepens眼科研究所Ilene Gipson教授惠贈(zèng)）按文獻(xiàn)報(bào)道方法培養(yǎng)［6］。將復(fù)蘇傳代的HCLE細(xì)胞用無血清K-SFM培養(yǎng)基懸浮，接種于100 m L培養(yǎng)瓶中（2×104／cm2），加入25 mg／L牛垂體浸膏、0.2μg／L EGF和0.4 mmol／L CaCl2，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至50%匯合時(shí)，更換為1∶1混合培養(yǎng)基（K-SFM和低鈣的DMEM／F12）繼續(xù)培養(yǎng)至滿匯合備用。

1.3 放射攝入實(shí)驗(yàn) 將HCLE細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板上，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞至80%～90%匯合。吸去培養(yǎng)液，在37℃環(huán)境下加入攝取緩沖液（含25 mmol／L Tris／HEPES，140 mmol／L NaCl，5.4 mmol／L KCl，1.8 mmol／L CaCl2，0.8 mmol／L MgSO4和5 mmol／L葡萄糖，p H 7.4）予孵育細(xì)胞1 h；然后加入不同濃度的［3H］-L-carnitine（0、100、200、300、400、500 nmol／L）和（或）非標(biāo)記LC；非特異性攝入管加入含有過量（100倍以上）非標(biāo)記LC（25 mmol／L）的攝取緩沖液；各管總放射性減去非特異性攝取管的放射性即為特異性攝取值。孵育結(jié)束后吸掉攝取緩沖液，迅速用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次30 s，以終止攝入反應(yīng)。將剩余PBS吸干凈，加入0.2 m L細(xì)胞裂解緩沖液（含0.1 mol／L Na OH和0.1%Triton X-100）充分裂解細(xì)胞，振蕩混勻。取10μL用于蛋白定量。另取100μL加入10 m L閃爍液，在液體閃爍計(jì)數(shù)器上測(cè)定細(xì)胞內(nèi)放射性強(qiáng)度，計(jì)算HCLE細(xì)胞攝?。?H］-L-carnitine的量。該實(shí)驗(yàn)共分7組，每組做3個(gè)平行管，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

HCLE細(xì)胞對(duì)LC的轉(zhuǎn)運(yùn)特性和相關(guān)參數(shù)根據(jù)下列米氏方程，采用Eadie-Hofstee和Lineweaver-Burk（雙倒數(shù)）作圖法分析計(jì)算。v＝Vmax1×［s］／（Km1＋［s］）＋Vmax2×［s］／（Km2＋［s］）。v為攝入反應(yīng)速率，Vmax為最大反應(yīng)速率，Km為米氏常數(shù)，［s］為底物濃度。

1.4 孵育時(shí)間和Na＋對(duì)HCLE細(xì)胞攝?。?H］-L-carnitine的影響 按上述方法準(zhǔn)備2板HCLE細(xì)胞，其中一板應(yīng)用含有Na＋的孵育緩沖液，另一板應(yīng)用不含Na＋的孵育緩沖液（將攝取緩沖液中的Na＋替換為相同濃度的膽堿）。每板24孔細(xì)胞，共分8組，每組3孔。在反應(yīng)體系中加入12 nmol／L的［3H］-L-carnitine，分別孵育0、10、20、40、60、90、120、180 min。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束時(shí)，迅速吸出孵育緩沖液，并加入冰冷的PBS終止反應(yīng)，其他細(xì)胞繼續(xù)孵育。全部時(shí)間點(diǎn)孵育完畢后收獲細(xì)胞，其余操作同前。

1.5 競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn) 按上述方法準(zhǔn)備2板HCLE細(xì)胞，其中一板用于LC抑制實(shí)驗(yàn)，另一板用于乙?；笮鈮A（acetyl-L-carnitine，ALC）抑制實(shí)驗(yàn)。每板24孔細(xì)胞，共分8組，每組3孔。在反應(yīng)體系中加入12 nmol／L［3H］-L-carnitine和不同濃度（0、0.05、0.1、0.5、1、500、1 000、25 000μmol／L）的非標(biāo)記LC或ALC，孵育30 min，收獲細(xì)胞。其余操作同前。測(cè)量結(jié)束后，以非標(biāo)記LC或ALC濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以［3H］-L-carnitine攝入量占對(duì)照組的百分比為縱坐標(biāo)，做抑制曲線，并計(jì)算各自的半數(shù)抑制濃度（50%inhibitory concen traton，IC50）值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用Student非配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 孵育時(shí)間和Na＋對(duì)HCLE細(xì)胞攝?。?H］-L-carnitine的影響 在反應(yīng)體系中加入12 nmol／L［3H］-L-carnitine，孵育不同時(shí)間后，HCLE細(xì)胞對(duì)［3H］-L-carnitine的攝取隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多，二者在90 min以內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。如果將攝取緩沖液中的Na＋替換為相同濃度的膽堿，HCLE細(xì)胞對(duì)［3H］-L-carnitine的攝取在各時(shí)間點(diǎn)均有所下降（P＜0.01，圖1）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們采用在Na＋存在的條件下孵育細(xì)胞30 min。

圖1 孵育時(shí)間和Na＋對(duì)人眼角膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)左旋肉堿的影響Figure 1 Time course and Na＋dependence of［3H］-L-carnitine uptake by HCLE cells

2.2 HCLE細(xì)胞攝?。?H］-L-carnitine的動(dòng)力學(xué)特征 HCLE細(xì)胞對(duì)［3H］-L-carnitine的攝取具有濃度依賴性，當(dāng)?shù)孜餄舛龋?00 nmol／L時(shí)，即達(dá)到飽和程度（圖2A）。根據(jù)米氏方程，Eadie-Hofstee作圖提示在HCLE細(xì)胞對(duì)［3H］-L-carnitine的攝取過程中，存在高親合力和低親合力2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（圖2B）。采用Lineweaver-Burk（雙倒數(shù)）作圖法分別對(duì)高親和力和低親合力轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行分析計(jì)算（圖2C，2D），高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)的米氏常數(shù)（Km）和最大攝取速率（Vmax）分別為（9.48±2.7）μmol／L和（0.48±0.09）pmol·h－1·mg－1蛋白；低親合力轉(zhuǎn)運(yùn)的Km和Vmax分別為（363.64±34.4）μmol／L和（5.1±0.3）pmol·h－1·mg－1蛋白。

圖2 左旋肉堿在人角膜上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)特性A.飽和曲線；B.Eadie-Hofstee作圖；C.Lineweaver-Burk（雙倒數(shù)）作圖法分別對(duì)高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行分析；D.Lineweaver-Burk（雙倒數(shù)）作圖法分別對(duì)低親合力轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行分析Figure 2 Characteristics of the kinetics of［3H］-L-carnitine uptake in HCLE cells

2.3 LC和ALC對(duì)HCLE細(xì)胞攝取［3H］-L-carnitine的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用 在反應(yīng)體系中加入不同濃度的LC或ALC，孵育30 min后，HCLE細(xì)胞對(duì)［3H］-L-carnitine的攝取被顯著抑制，且呈濃度依賴性（圖3）。LC和ALC的IC50值分別為（1.17± 0.27）μmol／L和（345.7±37.9）μmol／L。

圖3 不同濃度的左旋肉堿和乙?；笮鈮A對(duì)［3H］-L-carnitine在人角膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用Figure 3 Concentration-dependence of the inhibitory effects of L-carnitine and acetyl-L-carnitine on the uptake of［3H］-L-carnitine by HCLE cells

3 討 論

干眼癥又稱角結(jié)膜干燥癥，是眼科的常見病，可引起上皮干燥和角膜刺激征，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。引起干眼癥的關(guān)鍵因素之一是眼表滲透壓升高導(dǎo)致眼表上皮細(xì)胞皺縮甚至死亡。為緩解眼內(nèi)高滲狀態(tài)，人們?cè)谌斯I液中加入多種可溶性物質(zhì)，平衡眼內(nèi)滲透壓，有助于眼表組織細(xì)胞的生存［5］。有報(bào)道［7］認(rèn)為L(zhǎng)C具有調(diào)節(jié)滲透壓作用，可作為治療干眼癥的可溶性物質(zhì)之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)干眼癥患者局部應(yīng)用LC可以迅速、持久地改善眼部癥狀［5］。這些結(jié)果表明LC除了有助于長(zhǎng)鏈脂肪酸易化入線粒體形成乙酰化肉堿酯類進(jìn)行β-氧化以外，對(duì)保持眼內(nèi)局部滲透壓的穩(wěn)定具有重要作用。但左旋肉堿分子在HCLE細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制至今未明。

文獻(xiàn)［8］報(bào)道有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（organic cation transporter，OCTN）可轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，故又稱肉堿／有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。OCTN包括OCTN1、OCTN2和OCTN3亞型，其中OCTN3僅在小鼠體內(nèi)表達(dá)［9］。OCTN1和OCTN2屬于新型有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族成員，是與LC具有高親和力的運(yùn)輸?shù)鞍祝?－10］。本研究結(jié)果表明，HCLE細(xì)胞對(duì)LC的攝取具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。在一定范圍內(nèi)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)或底物濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)攝取的LC含量也逐漸增加，最終達(dá)到飽和狀態(tài)；同時(shí)，反應(yīng)體系中 Na＋的存在也是HCLE細(xì)胞攝取LC的必要條件。這些特性均符合OCTN1和OCTN2轉(zhuǎn)運(yùn)LC的特征。另外，本研究依據(jù)米氏方程，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行非線性回歸處理，Eadie-Hofstee作圖結(jié)果表明在HCLE細(xì)胞存在對(duì)LC高親合力和低親合力2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，并且利用Lineweaver-Burk作圖法分別計(jì)算了它們的Km和Vmax值。這些結(jié)果表明，HCLE細(xì)胞除了通過OCTN1和OCTN2攝取LC外，還可能通過其他低親合力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)緩慢攝取LC。這些低親合力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白需要進(jìn)一步研究證實(shí)。最后，本研究的競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，非標(biāo)記LC和ALC均可顯著抑制HCLE細(xì)胞對(duì)標(biāo)記LC的攝取，且呈濃度依賴性，從而證實(shí)了本反應(yīng)體系的特異性。

總之，HCLE細(xì)胞可通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程將淚液中的LC攝入細(xì)胞內(nèi)，在此過程中OCTN1和OCTN2發(fā)揮主要作用。本研究為進(jìn)一步闡明LC在HCLE細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及臨床應(yīng)用LC治療干眼癥提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

［1］ Zhang R，Zhang H，Zhang Z，et al.Neuroprotective effects of pre-treament with l-carnitine and acetyl-l-carnitine on ischemic injury in vivo and in vitro［J］.Int J Mol Sci，2012，13（2）：2078－2090.

［2］ 畢建成，安翠平，李寶全，等.肉堿缺乏癥的研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（8）：989－992.

［3］ 張忠霞，崔冬生，王濤，等.乙酰左旋肉堿預(yù)處理對(duì)低氧低糖誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2012，32（3）：364－366.

［4］ Khajavi N，Reinach PS，Skrzypski M，et al.L-carnitine reduces in human conjunctival epithelial cells hypertonic-induced shrinkage through interacting with TRPV1 channels［J］.Cell Physiol Biochem，2014，34（3）：790－803.

［5］ Nebbioso M，Evangelista M，Librando A，et al.Iatrogenic dry eye disease：an eledoisin／carnitine and osmolyte drops study［J］.Biomed Pharmacother，2013，67（7）：659－663.

［6］ Bandamwar KL，Papas EB，Garrett Q.Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells［J］.Cont Lens Anterior Eye，2014，37（3）：213－223.

［7］ Chen W，Zhang X，Li J，et al.Efficacy of osmoprotectants on prevention and treatment of murine dry eye［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54（9）：6287－6297.

［8］ Salsoso R，Guzmán-Gutiérrez E，Arroyo P，et al.Reduced L-carnitine transport in aortic endothelial cells from spontaneously hypertensive rats［J］.PLoS One，2014，9（2）：e90339.

［9］ Tamai I.Pharmacological and pathophysiological roles of carnitine／organic cation transporters（OCTNs：SLC22A4，SLC22A5 and Slc22a21）［J］.Biopharm Drug Dispos，2013，34（1）：29－44.

［10］ Pochin I L，Scalise M，Galluccio M，et al.OCTN cation transporters in health and disease：role as drug targets and assay development［J］.J Biomol Screen，2013，18（8）：851－867.

（本文編輯：趙麗潔）

Transport of L-carnitine in human corneal epithelial cells

LI Bao-quan1，BI Jian-cheng2，AN Cui-ping1，LI Yan-feng1，XU Shun-jiang3*
（1.Department of Clinical Laboratory，the First Hospital of Shijiazhuan g City，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Traditional Chinese Medicine Hospital of Hebei Province，Shijiazhuan g 050011，China；3.Department of Central Laboratory，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuan g 050031，China）

ObjectiveTo investigate the characteristics of L-carnitine（LC）import into human corneal limbal epithelia（HCLE）cells，and to provide an experimental basis for further study of transport mechanism of LC in human ocular epithelium.MethodsThe transport of［3H］-L-carnitine was determined using the radio uptake assay and the apparent kinetic parameters of carnitine uptake by HCLE were estimated by nonlinear regression curve fitting according to the Michaelis-Menten equation.ResultsThe uptake of LC into HCLE cells was saturable and time-dependent，and it also required the presence of Na＋in the external medium.An Eadie-Hofstee plot showed two distinct components：a high-and a low-affinity carnitine transport system in HCLE cells.The unlabelled LC and acetyl-L-carnitine competitively inhibited the uptake of［3H］-L-carnitine by HCLE cells.ConclusionL-carnitine is transported into HCLE cells from tears by an active carrier mediated transport system and exerts its biological function.

L-carnitine；epithelium，corneal；transcytosis

R322.91

A

1007-3205（2015）01-0048-04

2014－08－30；

2014－10－29

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題（20130136）

李寶全（1958－），男，山西寧武人，河北省石家莊市第一醫(yī)院主管檢驗(yàn)師，從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究。

*通訊作者。E-mail：sjxu66＠sina.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.018