韓 彬，趙俊鶯，何愛萍，舒 雅

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西西安710077）

右美托咪啶對脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞Toll樣受體4表達的影響

韓 彬，趙俊鶯，何愛萍，舒 雅*

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西西安710077）

目的觀察右美托咪啶對脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）表達的影響，并探討其可能的機制。方法 購買大鼠腎小管上皮細胞，經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)，均加入10μg／L脂多糖，均經(jīng)培養(yǎng)后分為3組。A組為空白對照組；B組為陽性對照組，加入右美托咪啶2.5μg；C組作為實驗組，先加入阿替美唑10μg，30 min后加入右美托咪啶2.5μg。繼續(xù)培養(yǎng)12 h。采取免疫組織化學(xué)法檢測3組細胞TLR4表達及TLR4m RNA水平，并測定3組細胞凋亡率。結(jié)果B組應(yīng)用右美托咪啶后，TLR4、TLR4m RNA和細胞凋亡率均低于A組（P＜0.01）；C組TLR4、TLR4m RNA和細胞凋亡率均高于B組（P＜0.01）。結(jié)論右美托咪啶可下調(diào)脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達，且右美托咪啶對TLR4的調(diào)節(jié)與α2腎上腺素能受體被激動相關(guān)。

右美托咪啶；脂多糖類；腎小管上皮細胞

膿毒癥患者臨床并不少見，患者病情危重，多數(shù)入住重癥監(jiān)護病房（intensive care unit，ICU）進行治療［1］。膿毒癥患者急性腎損傷發(fā)生率較高，為重要并發(fā)癥之一，是患者死亡的重要危險因素，嚴重者威脅患者的生命安全。右美托咪啶為近年臨床應(yīng)用廣泛的α2腎上腺素能受體（α2adrenogic recptor，α2AR）激動劑，其可激動機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的α2AR，發(fā)揮鎮(zhèn)靜、催眠作用［2］。相關(guān)研究［3－5］表明，右美托咪啶于ICU應(yīng)用取得較為滿意的鎮(zhèn)靜效果的同時對患者重要器官具有一定保護作用，本研究旨在探討右美托咪啶對于膿毒癥大鼠腎小管上皮細胞Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）表達的影響，以評估其對腎臟的保護作用，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 大鼠腎小管上皮細胞由西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室提供；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，批號L2880，購于天津灝洋生物制品有限公司）；右美托咪啶（批號09081232，購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（購于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司；PTPCR試劑（購于大連寶生物工程有限公司）；引物合成（購于傷害生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；PCR擴增儀（購于美國PE公司）。

1.2 細胞復(fù)蘇 研究人員于液氮罐中取出細胞，經(jīng)復(fù)蘇后接種細胞于50 m L玻璃瓶中，于MEM培養(yǎng)基中行常規(guī)培養(yǎng)，MEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U／m L青霉＋100 U／m L鏈霉素等。將培養(yǎng)基置入37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱，并于每1～2 h更換培養(yǎng)基1次；待細胞長成致密單層后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1×105濃度接種于24孔板中，使細胞貼壁生長18～24 h。再加入LPS（10μg／L）培養(yǎng)12 h。然后隨機分為3組，每組10只。

1.2.1 實驗分組 A組為空白對照組；B組為陽性對照組，加入右美托咪啶2.5μg；C組為實驗組，先加入阿替美唑（α2AR阻滯劑）10μg，30 min后加入右美托咪啶2.5μg。3組均繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.2.2 TLR4及TLR4m RNA水平測定 采用免疫組織化學(xué)方式測定3組大鼠腎臟組織TLR4水平。嚴格按照試劑說明進行TLR4m RNA水平測定。TLR4上游引物為5′-GTCCATCGGTTGATCTTGGGA-3′，下游引物為5′-AGAATTGCCAGCCATTTTTAA-3′，擴增片段長度為681 bp。本研究以β-action為內(nèi)參，其中β-action上游引物為5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′，下游引物為5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAAACC-3′，擴增片段長度為281 bp。PCR反應(yīng)體系反應(yīng)條件：94℃環(huán)境下變性，時間5min，然后按照94℃30 s、51℃40 s、72℃60 s，行擴增30個循環(huán)，最后于72℃下延伸5 min。最后取各組樣本產(chǎn)物5μL，與溴酚藍載樣緩沖液1μL一起加入1.5%瓊脂糖凝聚樣品孔中，于70 V恒壓下電泳20 min，應(yīng)用DH2000凝膠圖像分析系統(tǒng)進行分析，以TLR4m RNA條帶灰度值與β-action條帶灰度值比值作為TLR4m RNA表達水平。

1.2.3 細胞凋亡檢測 使用PBS洗滌3組細胞，吸取含細胞平衡液100μL至離心管，加入5μL Annexin V-FITC及5μL PI，避光室溫反應(yīng)15 min，加入400μL平衡液，在流式細胞儀上檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢測。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

3組大鼠腎臟組織TLR4水平及TLR4mRNA水平分析：B組應(yīng)用右美托咪啶后，TLR4、TLR4m RNA水平和細胞凋亡率均低于A組（P＜0.01）；C組TLR4、TLR4m RNA和細胞凋亡率均高于B組（P＜0.01）；C組TLR4、TLR4mRNA和細胞凋亡率與A組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組大鼠腎臟組織TLR4、TLR4mRNA水平以及細胞凋亡率比較Table 1 TLR4，TLR4mRNA and apoptosis rate in rat kidney tissue of three groups（n＝10，±s）

表1 3組大鼠腎臟組織TLR4、TLR4mRNA水平以及細胞凋亡率比較Table 1 TLR4，TLR4mRNA and apoptosis rate in rat kidney tissue of three groups（n＝10，±s）

*P＜0.01與A組比較 ＃P＜0.01與B組比較（q檢驗）

組別 TLR4（IOD，×103） TLR4m RNA 細胞凋亡率（%）A組 97.52±21.43 0.93±0.05 67.45±11.43 B組 45.13±13.51* 0.46±0.02* 34.62±7.61*C組 87.43±19.40＃ 0.81±0.04＃ 66.22±10.95＃F22.766 397.556 33.682P0.000 0.000 0.000

3 討 論

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）為膿毒血較為常見、嚴重的并發(fā)癥之一，AKI主要指由各種原因所致機體腎功能在幾小時至幾天內(nèi)突然下降而出現(xiàn)的臨床綜合征［6－7］。研究［8］表明，約47.5%膿毒癥患者發(fā)生AKI，病死率高達70.2%，腎功能的下降嚴重威脅患者的生命安全。

右美托咪啶為新型高選擇性α2AR激動劑，其機制為通過激動中樞神經(jīng)系統(tǒng)α2腎上腺素能最密集的區(qū)域——腦干藍斑（負責調(diào)節(jié)覺醒與睡眠），引發(fā)并維持自然非動眼睡眠狀態(tài)，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠作用。除鎮(zhèn)靜作用外，右美托咪啶還具有鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定血流動力學(xué)和利尿的效應(yīng)。由于其良好的鎮(zhèn)靜和穩(wěn)定血流動力學(xué)作用，右美托咪啶可用于ICU患者的鎮(zhèn)痛，而且有研究［5］表明右美托咪啶對膿毒癥大鼠的腎功能具有一定的保護作用，能改善尿量，降低尿素氨，減少腎衰竭的發(fā)生。動物實驗［9－10］表明，膿毒癥時動物血清中的炎性因子明顯升高，右美托咪啶能夠降低膿毒癥大鼠血清腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β和白細胞介素6，提高膿毒癥大鼠的存活率。由于LPS與腎臟TLR4相結(jié)合，激活TLR4信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致IκB從IκB／核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）復(fù)合物釋放，NF-κB由此活化轉(zhuǎn)位進核，使信號下游致炎因子腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β和白細胞介素6分泌增多，導(dǎo)致AKI，已成為學(xué)者們的共識。所以，要防治膿毒癥導(dǎo)致的AKI就要靶向性針對TLR4及其信號通路，通過下調(diào)TLR4的表達或抑制TLR4信號通路，實現(xiàn)從根源上控制炎性反應(yīng)對腎臟的損傷。而右美托咪啶可降低膿毒癥大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達，達到腎臟保護作用。本研究結(jié)果表明，B組腎小管上皮細胞TLR4表達水平明顯低于A組（P＜0.01），可見右美托咪啶可下調(diào)腎小管上皮細胞TLR4表達，發(fā)揮腎臟保護作用；而C組應(yīng)用α2AR阻滯劑后再應(yīng)用右美托咪啶，TLR4、TLR4m RNA及細胞凋亡均高于B組，可見右美托咪啶下調(diào)TLR4表達發(fā)揮腎臟保護作用與α2AR被激動有關(guān)。

總之，右美托咪啶可降低膿毒癥大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達水平，在取得較佳鎮(zhèn)靜效果的同時保護腎功能，且TRL4下調(diào)與α2AR被激動有重要關(guān)聯(lián)。

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（本文編輯：許卓文）

Influence of dexmedetomidine on Toll-like receptor 4 in renal tubular epithelial cells of rat injured by lipopolysaccharide

HAN Bin，ZHAO Jun-ying，HE Ai-ping，SHU Ya*
（Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Xi′an Medical University，Xi′an 710077，China）

ObjectiveTo observe the effect of dexmedetomidine for Toll-like receptor 4（TLR4）in renal tubular epithelial cells on rat injured by lipopolysaccharide（LPS），then to explore the possible mechanism.MethodsRat renal tubular epithelial cells were purchased，recovered，cultured，then added LPS 10μg／L and were cultured and divided into three groups，group A，the blank control group，group B added dexmedetomidine 2.5μg as control group，group C joined atipamezole 10μg and added dexmedetomidine 2.5μg after 30 min as the experimental group，all continued culture for 12 h.Then，immunohistochemistry was used to measure TLR4 protein expression and TLR4mRNA in three groups，and the apoptosis rate of three groups were determined.ResultsAfter using dexmedetomidine，TLR4，TLR4m RNA and apoptotic rate of group B were lower than those of A group（allP＜0.01），while TLR4，TLR4m RNA and apoptosis rate of group C were higher than those of group B（allP＜0.01）.ConclusionDexmedetomidine can downregulate TLR4 expression in renal tubular epithelial cells of the rat injured by LPS，and the regulation for TLR4 of dexmedetomidine is related withα2adrenoglc recptor excited.

dexmedetomidine；lipopolysaccharide；renal tubular epithelial cells

R614

A

1007-3205（2015）01-0042-03

2014－08－22；

2014－10－18

陜西省教育廳專項科研計劃項目（2013JK0795）；西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院院級基金項目（XYFY2013-07）

韓彬（1982－），男，陜西西安人，西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床麻醉學(xué)研究。

*通訊作者

10.3969／ji.ssn.1007-3205.2015.01.016