高 峰，姚 敏，王曉梅，劉淑霞，段惠軍*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院病理科，河北石家莊050051；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)研究室，河北石家莊050017；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，河北石家莊050017）

纈沙坦對糖尿病小鼠腎小球組織Notch通路活化及足細(xì)胞丟失的影響

高 峰1，姚 敏2，王曉梅1，劉淑霞3，段惠軍3*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院病理科，河北石家莊050051；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)研究室，河北石家莊050017；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，河北石家莊050017）

目的 探討應(yīng)用纈沙坦對糖尿病小鼠腎小球組織中Notch通路活化及足細(xì)胞丟失的影響。方法 建立糖尿病小鼠模型給予纈沙坦治療，觀察小鼠腎小球細(xì)胞凋亡及足細(xì)胞脫落情況，采用Western blot檢測Notch胞內(nèi)域1（Notch intracellular domain 1，NICD1）、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況，Real-time PCR檢測Hes1和Hey1 m RNA表達(dá)情況。結(jié)果纈沙坦可降低糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞凋亡及足細(xì)胞脫落，減少糖尿病小鼠腎小球組織中NICD1、Hes1、Hey1、Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)，增加Bcl-2表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論纈沙坦可通過抑制糖尿病小鼠腎小球組織中Notch通路的活化，減少足細(xì)胞凋亡和脫落。

糖尿病腎??；足細(xì)胞；腎小球

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是引起終末期慢性腎衰竭的一種常見原因。Notch通路在后腎形成過程中對足細(xì)胞分化起到重要作用，其受體向細(xì)胞內(nèi)釋放出活化形式Notch胞內(nèi)域（Notch intracellular domain，NICD）后，激活下游基因Hes1和Hey1，影響細(xì)胞的分化和凋亡，但Notch通路在DN發(fā)病過程中是否影響足細(xì)胞丟失尚不清楚［1］。本研究通過建立糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）小鼠模型，給予血管緊張素Ⅱ1受體阻斷劑

（angiotensinⅡtype 1 receptor antagonism，AT1Ra）纈沙坦干預(yù)治療，觀察其是否影響DM小鼠腎小球組織中Notch通路活化及腎小球細(xì)胞凋亡、足細(xì)胞脫落，旨在為DN的治療提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 CD-1小鼠購自北京維通利華公司。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma公司。兔抗NICD1、Hes1和Hey1多克隆抗體購自Abcam公司。兔抗Bax和Bcl-2多克隆抗體購自Proteintech公司。兔抗cleaved caspase-3多克隆抗體購自Cell Signal公司。兔抗β-actin多克隆抗體購自北京博奧森公司。組織RNA提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。Real-time PCR試劑盒購自Takara公司。小鼠足盂蛋白（podocalyxin，PCX）ELISA檢測試劑盒購自上海藍(lán)基生物科技公司。纈沙坦為北京諾華公司產(chǎn)品。

1.2 DM小鼠模型建立及分組 18只雄性CD-1小鼠（20～25 g，4周）隨機分為3組，對照組、DM組、DM＋纈沙坦組。DM小鼠腹腔注射STZ（150 mg／kg），對照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液。DM＋纈沙坦組小鼠在DM模型建立后，以纈沙坦（40 mg／kg）灌胃，對照組和DM組以相當(dāng)體積的蒸餾水灌胃。于動物成模后4周，分別用代謝籠收集24 h尿，用于尿蛋白及PCX測定；取部分腎組織經(jīng)篩網(wǎng)法分離腎小球組織，用于Western blot、Real-time PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3 ELISA檢測尿PCX含量 在反應(yīng)孔內(nèi)分別加入稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品50μL或待測小鼠尿液樣品50μL，隨后立即加入50μL生物素標(biāo)記的抗體，37℃孵育45 min；甩去孔內(nèi)液體，振蕩洗滌。每孔加入親和鏈酶素-HRP，37℃孵育30 min。甩去孔內(nèi)液體，振蕩洗滌后，每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育5 min，加入50μL終止液，在450 nm波長處測定各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.4 Western blot檢測NICD1、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá) 用RIPA裂解液（含1×PBS，1%NP-40，0.5%去氧膽酸鈉，0.1%SDS，用前加PMSF 0.1 g／L）提取腎小球組織總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測定其蛋白濃度，取100μg樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，分別加入兔抗NICD1、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、β-actin多克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜后滴加適量辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，于37℃孵育2 h，將ECL試劑盒中的A液和B液等量混合，滴加于膜上，在暗室中顯影，底片經(jīng)掃描后，以測量蛋白與β-actin OD的比值表示其相對表達(dá)量。

1.5 Real-time PCR檢測Hes1、Hey1 m RNA的表達(dá) 應(yīng)用RNA prep pure組織總RNA提取試劑盒提取腎小球組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄總體系為20μL，按照反轉(zhuǎn)錄說明書催化合成cDNA。引物分別為，18S，上游5′-CGC CGC TAG AGG TGA AAT TC-3′，下游5′-CCA GTC GGC ATC GTT TAT GG-3′；Hes1，上游5′-CAC GAC ACC GGA CAA ACC A-3′，下游5′-GCC GGG AGC TAT CTT TCT TAA GTG-3′；Hey1，上游5′-AAG ACG GAG AGG CAT CAT CGA G-3′，下游5′-CAG ATC CCT GCT TCT CAA AGG CAC-3′，均由北京奧科公司合成。PCR反應(yīng)總體系為50μL，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性25 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)結(jié)束。由PCR反應(yīng)曲線得到達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（cycle threshold value，Ct）值，采用2－△△Ct法計算相對定量結(jié)果。

1.6 流式細(xì)胞術(shù) 將分離的腎小球組織用網(wǎng)搓法制成單細(xì)胞懸液。向單細(xì)胞懸液中加入DNA染液1 m L，4℃染色30 min，立即放入Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測。應(yīng)用Expo32ADC軟件，以二倍體細(xì)胞峰前出現(xiàn)的亞二倍體峰作為凋亡細(xì)胞峰，根據(jù)其分布組方圖計算腎小球細(xì)胞的凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 纈沙坦對DM小鼠尿蛋白及PCX含量的影響

與對照組相比，DM組和DM＋纈沙坦組小鼠尿蛋白及PCX含量均顯著增加（P＜0.05）；DM＋纈沙坦組較DM組降低（P＜0.05）。見表1。

表1 纈沙坦對DM小鼠尿蛋白及PCX含量的影響Table 1 Effect of valsartan on urinary protein excretion and concentration of PCX in diabetic mice（n＝6，±s）

表1 纈沙坦對DM小鼠尿蛋白及PCX含量的影響Table 1 Effect of valsartan on urinary protein excretion and concentration of PCX in diabetic mice（n＝6，±s）

*P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與DM組比較（q檢驗）

組別 尿蛋白（mg／24 h） PCX（μg／L）對照組 5.732±1.117 6.427±1.218 DM組 8.584±1.543* 12.471±3.174*DM＋纈沙坦組 7.307±1.321*＃ 8.490±1.251*＃F6.720 18.688P0.024 0.000

2.2 纈沙坦抑制DM小鼠腎小球組織Notch通路活化 DM組小鼠腎小球組織中NICD1、Hes1、Hey1蛋白較對照組均明顯增加（P＜0.05），給予纈沙坦治療后表達(dá)降低，但仍高于對照組（P＜0.05），見圖1，表2。Hes1和Hey1 m RNA在DM組腎小球組織表達(dá)較對照組增加（P＜0.05），DM＋纈沙坦組較DM組表達(dá)降低（P＜0.05），見表3。

圖1 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織NlCD1、Hes1和Hey1蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of valsartan on protein expression of NICD1，Hes1 and Hey1 in glomerular tissues of diabetic mice

表2 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織NlCD1、Hes1和Hey1蛋白表達(dá)的影響Table 2 Effect of valsartan on protein expression of NICD1，Hes1 and Hey1 in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s）

表2 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織NlCD1、Hes1和Hey1蛋白表達(dá)的影響Table 2 Effect of valsartan on protein expression of NICD1，Hes1 and Hey1 in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s）

*P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與DM組比較（q檢驗）

組別 NICD1 Hes1 Hey1對照組 0.058±0.010 0.102±0.042 0.206±0.084 DM組 0.914±0.216* 0.384±0.186* 0.325±0.171*DM＋纈沙坦組 0.527±0.142*＃0.212±0.096*＃0.274±0.125*＃F21.718 9.288 8.633P0.000 0.002 0.008

表3 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織Hes1和Hey1 mRNA表達(dá)的影響Table 3 Effect of valsartan on m RNA expression of Hes1 and Hey1 in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s）

表3 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織Hes1和Hey1 mRNA表達(dá)的影響Table 3 Effect of valsartan on m RNA expression of Hes1 and Hey1 in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s）

*P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與DM組比較（q檢驗）

?

2.3 纈沙坦抑制腎小球細(xì)胞凋亡 腎小球組織中Bax和cleaved caspase-3蛋白在DM組和DM＋纈沙坦組比對照組表達(dá)增加，DM＋纈沙坦組較DM組表達(dá)降低（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)水平DM組較對照組降低，給予纈沙坦后表達(dá)升高，但仍低于對照組（P＜0.05），見圖2和表4。流式細(xì)胞術(shù)顯示DM小鼠腎小球內(nèi)細(xì)胞凋亡率較C組增加（P＜0.05），DM＋纈沙坦組比DM組有所降低（P＜0.05），見圖3和表4～5。

圖2 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of valsartan on protein expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in glomerular tissues of diabetic mice

表4 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響Table 4 Effect of valsartan on protein expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s）

表4 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響Table 4 Effect of valsartan on protein expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s）

*P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與DM組比較（q檢驗）

組別 Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3對照組 0.087±0.012 0.623±0.123 0.012±0.001 DM組 0.972±0.093* 0.093±0.034* 0.071±0.005*DM＋纈沙坦組 0.638±0.116*＃0.382±0.086*＃0.043±0.009*＃F36.839 24.832 17.728P0.000 0.002 0.000

表5 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織細(xì)胞凋亡的影響Table 5 Effect of valsartan on cell apoptosis in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s，%）

表5 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織細(xì)胞凋亡的影響Table 5 Effect of valsartan on cell apoptosis in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s，%）

*P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與DM組比較（q檢驗）

組別 腎小球組織細(xì)胞凋亡率對照組 6.245±1.251 DM組 13.536±3.412*DM＋纈沙坦組 11.964±2.325*＃F8.527P0.003

圖3 纈沙坦對DM小鼠腎小球組織細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of valsartan on cell apoptosis in glomerular tissues of diabetic mice

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)在DM小鼠腎小球組織中Notch通路重要活化形式NICD1及其下游基因Hes1、Hey1表達(dá)較對照組小鼠明顯增加，提示在早期DM小鼠腎組織中Notch通路已經(jīng)被激活。在DM早期腎組織中，血糖及血流動力學(xué)等改變可誘導(dǎo)足細(xì)胞Notch通路的活化，向足細(xì)胞內(nèi)釋放出NICD1，并激活其下游調(diào)控基因Hes1及Hey1，參與足細(xì)胞的損傷［2］。

足細(xì)胞是腎小球內(nèi)終末分化的上皮細(xì)胞，是構(gòu)成腎小球濾過膜的重要部分［3］。已證實腎小球內(nèi)足細(xì)胞丟失直接關(guān)系到DN的進(jìn)展程度［4］。足細(xì)胞丟失主要原因包括足細(xì)胞凋亡和足細(xì)胞從腎小球基底膜脫落2個方面。在DN發(fā)展過程中，足細(xì)胞損傷可引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白分布異常，表達(dá)量減少，足細(xì)胞與腎小球基底膜之間黏附性下降，造成足細(xì)胞從基底膜上脫落，進(jìn)入尿液。PCX是足細(xì)胞的特異標(biāo)記蛋白，位于足突頂膜區(qū)，尿PCX含量可以反映尿液中足細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而代表足細(xì)胞脫落情況［5］。通過ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，DM小鼠尿液PCX含量較對照組小鼠明顯增加，提示DM小鼠從腎小球基底膜脫落進(jìn)入尿液的足細(xì)胞數(shù)量增加。另外，我們發(fā)現(xiàn)DM小鼠腎小球組織中細(xì)胞凋亡增多，在DN的早期，腎小球內(nèi)的凋亡細(xì)胞主要為足細(xì)胞［6］。同時發(fā)現(xiàn)腎小球組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生改變，表現(xiàn)為Bax蛋白表達(dá)增多，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax／Bcl-2比值升高，cleaved caspase-3生成增加。Liu等［7］也發(fā)現(xiàn)高糖可刺激足細(xì)胞凋亡增加，伴隨Bax／Bcl-2比值改變，cleaved caspase-3生成增加。足細(xì)胞凋亡和脫落造成腎小球內(nèi)足細(xì)胞數(shù)量減少，腎小球濾過屏障嚴(yán)重破壞，發(fā)生蛋白尿，誘導(dǎo)腎小球纖維化，最終導(dǎo)致慢性腎衰竭。

研究顯示在DN腎組織中存在腎素－血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）的激活［8］。AT1Ra通過拮抗血管緊張素Ⅱ1受體（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R），抑制DN腎組織中RAS，產(chǎn)生對腎臟的保護(hù)作用，而這種作用不僅僅取決于血壓降低［9］。Zhou等［10］發(fā)現(xiàn)RAS通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在DM小鼠腎組織中加速腎小球硬化，給予小鼠纈沙坦治療可減輕足細(xì)胞損傷，延緩腎小球硬化的進(jìn)程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纈沙坦也能明顯抑制DM小鼠腎小球組織中Notch通路的活化。在DM小鼠給予纈沙坦治療后，Notch通路的活化形式NICD1及其下游蛋白表達(dá)均明顯降低，提示在DM小鼠早期腎組織中RAS可激活Notch信號通路。還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用纈沙坦治療后，在抑制Notch通路活化的同時，Bax／Bcl-2比值降低，cleaved caspase-3減少，腎小球內(nèi)細(xì)胞凋亡率降低，尿蛋白及PCX含量減少，說明纈沙坦具有通過抑制Notch通路，進(jìn)而減少足細(xì)胞丟失，降低蛋白尿，延緩腎小球硬化的作用。

［1］ Ji X，Wang Z，Geamanu A，et al.Inhibition of cell growth and induction of apoptosis in non-small cell lung cancer cells by delta-tocotrienol is associated with notch-1 down-regulation［J］.J Cell Biochem，2011，112（10）：2773－2783.

［2］ Bonegio R，Susztak K.Notch signaling in diabetic nephropathy［J］.Exp Cell Res，2012，318（9）：986－992.

［3］ 張金平，段小婷，賀德剛，等.肝細(xì)胞生長因子對阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞人腎蛋白表達(dá)的影響［J］.臨床薈萃，2013，28（11）：1255－1258.

［4］ Paeng J，Chang JH，Lee SH，et al.Enhanced glycogen synthase kinase-3βactivity mediates podocyte apoptosis under diabetic conditions［J］.Apoptosis，2014，19（12）：1678－1690.

［5］ 邢燕，葉山東，胡聞，等.吡格列酮對糖尿病大鼠腎組織podocalyxin表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27（7）：992－997.

［6］ Drapeau N，Lizotte F，Denhez B，et al.Expression of SHP-1 induced by hyperglycemia prevents insulin actions inpodocytes［J］.Am JPhysiol Endocrinol Metab，2013，304（11）：E1188－1198.

［7］ Liu W，Zhang Y，Hao J，et al.Nestin protects mouse podocytes against high glucose-induced apoptosis by a Cdk5-dependent mechanism［J］.J Cell Biochem，2012，113（10）：3186－3196.

［8］ Urushihara M，Kobori H.Angiotensinogen expression is enhanced in the progression of glomerular disease［J］.Int J Clin Med，2011，2（1）：378－387.

［9］ Bishnoi HK，Mahadevan N，Balakumar P.The combined strategy with PPARαagonism and AT1 receptor antagonism is not superior relative to their individual treatment approach in preventing the induction of nephropathy in the diabetic rat［J］.Pharmacol Res，2012，66（4）：349－356.

［10］ Zhou G，Cheung AK，Liu X，et al.Valsartan slows the progression of diabetic nephropathy in db／db mice via a reduction in podocyte injury，and renal oxidative stress and inflammation［J］.Clin Sci（Lond），2014，126（10）：707－720.

（本文編輯：劉斯靜）

Effect of valsartan on Notch pathway activation and podocyte loss in glomeruli of diabetic mice

GAO Feng1，YAO Min2，WANG Xiao-mei1，LIU Shu-xia3，DUAN Hui-jun3*
（1.Department of Pathology，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China；2.Department of Biochemistry，the Basic Medical College，Hebei Medical University，Shijiazhuan g 050017，China；3.Department of Pathology，the Basic Medical College of Hebei Medical University，Shijiazhuan g 050017，China）

ObjectiveTo investigate the effect of valsartan on activation of Notch pathway and podocyte loss.MethodsApoptosis and podocyte detachment of glomeruli were measured after diabetic mice were treated with valsartan.The levels of Notch intracellular domain 1（NICD1），Hes1，Hey1，Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot.Realtime PCR was used to evaluate Hes1 and Hey1 m RNA expression.ResultsValsartan suppressed cell apoptosis and podocyte detachment of glomeruli in diabetic mice.Valsartan also inhibited overexpression of NICD1，Hes1，Hey1，Bax and cleaved caspase-3，and increased Bcl-2 level in glomerular tissues of diabetic mice（P＜0.05）.ConclusionValsartan inhibits the activation of Notch pathway in glomerular tissues of diabetic mice，also inhibits podocyte apoptosis and detachment.

diabetic nephropathies；podocytes；kidney glomerulus

R587.24；R972.2

A

1007-3205（2015）01-0001-05

2014－09－11；

2014－11－18

河北省自然科學(xué)基金（H2014206294）；河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題（20130229）

高峰（1978－），男，河北邯鄲人，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事糖尿病腎病診治研究。

*通訊作者

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.001