靳怡然,田婷婷，賀　璠，馬英華，許慧君，杜英峰*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定地榆槐角丸中9種化學(xué)成分

靳怡然1,2,田婷婷1，賀璠1，馬英華1，許慧君1，杜英峰1*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000)

[摘要]目的建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定地榆槐角丸中蘆丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黃芩苷、染料木素、蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素含量的方法。方法采用C18色譜柱，乙腈-0.1%乙酸水為流動(dòng)相，梯度洗脫。采用電噴霧離子源，監(jiān)測(cè)模式為負(fù)離子，定量檢測(cè)采用多重反應(yīng)離子模式。結(jié)果在15 min內(nèi)地榆槐角丸中9種有效成分在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，加樣回收率(n=3)分別為96.2%、97.5%、98.3%、99.6%、97.5%、100.1%、94.2%、98.7%和99.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值分別為1.3%、1.2%、1.4%、1.7%、0.5%、0.54%、0.9%、1.0%和0.82%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性高，可用于地榆槐角丸的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]地榆槐角丸；色譜法，液相；串聯(lián)質(zhì)譜法；含量測(cè)定

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.001

地榆槐角丸是由地榆炭、蜜槐角、炒槐花、大黃、黃芩等12味中藥組成的市售中藥復(fù)方制劑，屬國(guó)家中藥保護(hù)品種，收載于2010年版《中國(guó)藥典》一部，現(xiàn)有大蜜丸和水蜜丸2種劑型。臨床上主要用于治療臟腑實(shí)熱、大腸火盛所致的腸風(fēng)便血、痔瘡肛瘺、濕熱便秘、肛門腫痛等癥[1]。中藥材的質(zhì)量受多種因素影響，如藥材的基源、產(chǎn)地、采收期等，且中成藥是多種藥味按不同生產(chǎn)工藝制成的，其質(zhì)量更具有不穩(wěn)定性和不均一性，因此僅靠一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)化學(xué)成分作為定量指標(biāo)來控制中成藥的質(zhì)量是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。2010年版《中國(guó)藥典》僅收載以槐角苷為指標(biāo)成分，文獻(xiàn)報(bào)道也僅對(duì)地榆槐角丸中單一成分或少數(shù)幾個(gè)成分如芍藥苷、橙皮苷、黃芩苷等進(jìn)行含量測(cè)定來控制制劑質(zhì)量[2-3]，但地榆槐角丸成分復(fù)雜，任何單一成分均不能全面地反映地榆槐角丸的質(zhì)量。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)對(duì)地榆槐角丸中蘆丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黃芩苷、染料木素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素9種主要成分進(jìn)行定量分析，旨在為更好地控制地榆槐角丸的質(zhì)量提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器美國(guó)安捷倫-1200 高效液相色譜儀，配有G1322A型在線脫氣儀，G1311A型四元梯度洗脫泵，G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Applied Biosystems/MDS Sciex公司3200-QTRAPTM質(zhì)譜儀，質(zhì)量分析器為三重四極桿線性離子肼串聯(lián)，TurboV離子源，Analyst 1.5.2分析軟件。德國(guó)Satrorius公司BP211D型電子分析天平。乙腈(色譜純)，水為重蒸水。

1.2試藥槐角苷、染料木苷、染料木素、蘆薈大黃素對(duì)照品購于成都曼斯特生物科技有限公司，其純度大于98%；蘆丁、大黃酸、大黃素、黃芩苷和柚皮苷對(duì)照品購于中國(guó)食品藥品檢定研究院。地榆槐角丸(大蜜丸：批號(hào) 2010626、2010913、2010821)均由北京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。

2方法與結(jié)果

2.1色譜和質(zhì)譜條件色譜柱為安捷倫Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-含0.1%乙酸水(B)，梯度洗脫0～5 min，5%A；5～10 min，5%～30%A；10～15 min，30%～80%A；15～20 min，80%～95%A；20～20.1 min，95%～5%A；柱溫30 ℃；流速0.7 mL/min。

離子源為電噴霧離子源；負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)：源噴射電壓為-4 500 V；離子源溫度為650 ℃。霧化氣、加熱氣和簾氣分別為60、65和25 arbitrary units，接口加熱，檢測(cè)過程全程通入氮?dú)狻６糠椒ú捎枚嘀胤磻?yīng)離子模式。9種被測(cè)成分的離子對(duì)、出峰時(shí)間、解簇電壓和碰撞電壓見表1。儀器操作軟件Analyst 1.5.2，由Applied Biosystems/MDS Sciex提供。

表1　被測(cè)化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1　HPLC-ESI-MSn Data of the components

2.2溶液配制

2.2.1對(duì)照品溶液的制備分別稱取蘆丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黃芩苷、染料木素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素對(duì)照品適量，精密稱定，各置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得濃度分別為0.101、0.108、0.091、0.113、0.094、0.124、0.147、0.124和0.096 g/L的對(duì)照品貯備液。精密量取上述各貯備液適量，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容，搖勻，即得一定濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取地榆槐角丸大蜜丸，剪碎，混勻，取本品約0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，然后精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(超聲儀功率：100 W；頻率：25 kHz)30 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL 進(jìn)樣分析。供試品和對(duì)照品溶液的色譜圖見圖1。

圖1地榆槐角丸樣品多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

A.對(duì)照品；B.樣品

1.蘆丁；2.槐角苷；3.柚皮苷；4.染料木苷；5.黃芩苷；6.染料木素；7.蘆薈大黃素；8.大黃酸；9.大黃素對(duì)照品

Figure 1Representative extractions chromatograms of nine compounds in Di-Yu-Huai-Jiao pill

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察精密吸取9種待測(cè)化合物對(duì)照品混合溶液適量，用50%甲醇分別定量稀釋成原濃度的1、2、4、8、16和32倍。按已經(jīng)確定的色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定。以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)X(μg/mL)，以待測(cè)化合物的峰面積A為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2　被測(cè)成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 2　Regression equations,correlation coefficients and linearity ranges of the nine compounds

2.3.2精密度取同一對(duì)照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰的峰面積，并計(jì)算各峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。結(jié)果顯示蘆丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黃芩苷、染料木素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值分別為1.7%，2.3%，0.7%，1.5%，0.4%，1.7%，2.2%，1.1%和1.2%，均符合精密度實(shí)驗(yàn)的要求。說明該方法的精密度良好。

2.3.3重復(fù)性取批號(hào)為2010626地榆槐角丸5份，每份精密稱取約0.5 g，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算9種被測(cè)成分含量的RSD。結(jié)果顯示蘆丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黃芩苷、染料木素、蘆薈大黃素，大黃酸和大黃素的含量RSD值分別為0.81%、0.63%、0.57%、0.71%、0.46%、0.71%和0.89%，均符合規(guī)定。表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4供試品溶液穩(wěn)定性取同一份批號(hào)為2010626地榆槐角丸供試品溶液，分別于0、6、12、8和24 h進(jìn)樣分析，并記錄各待測(cè)化合物的峰面積。結(jié)果顯示9種被測(cè)化合物蘆丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黃芩苷、染料木素、蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素的RSD值分別為0.70%、0.81%、0.63%、0.42%、0.91%、0.51%、0.72%、1.21%和0.91%。表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h，穩(wěn)定性良好，可以滿足樣品測(cè)定的需要。

2.3.5回收率取批號(hào)為2010626，且已知含量的地榆槐角丸，精密稱取約0.25 g，共9份，分別精密加入高、中、低3個(gè)水平的對(duì)照品，每個(gè)水平3份，然后按上述方法操作制備供試品溶液并分析、計(jì)算。結(jié)果顯示蘆丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黃芩苷、染料木素、蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素的平均回收率分別為96.2%、97.5%、98.3%、99.6%、97.5%、100.1%、94.2%、98.7%和99.7%，RSD值分別為1.3%、1.2%、1.4%、1.7%，0.5%、0.5%、0.9%、1.0%和0.8%。表明方法加樣回收率結(jié)果良好，測(cè)定方法準(zhǔn)確。

2.4樣品測(cè)定取地榆槐角丸3批(大蜜丸：批號(hào) 2010626、2010913、2010821)，按上述方法制備供試品溶液后按前述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，分別記錄9個(gè)待測(cè)化合物色譜峰面積，將待測(cè)化合物的峰面積代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算蘆丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黃芩苷、染料木素、蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素的含量。每批樣品測(cè)定3份，結(jié)果見表3。

表3　地榆槐角丸中9種有效成分含量統(tǒng)計(jì)Table 3　Contents of nine compounds inDi-Yu-Huai-Jiao pill　(n=3，mg/丸,RSD)

3討論

3.1定量指標(biāo)的選擇地榆槐角丸中地榆碳、槐角和槐花三者均有清熱涼血，尤善治下部出血的作用，為方中君藥，方中黃芩、大黃等具有清熱涼血、通便導(dǎo)滯之功效，為臣藥，枳殼理氣消積，寬暢通便，為使藥。因此，本研究選取了槐角和槐花的主要有效成分槐角苷、染料木苷、染料木素[4-5]，黃芩中主要有效成分黃芩苷，大黃中主要有效成分大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素以及枳殼中的主要有效成分柚皮苷作為定量指標(biāo)[6-10]。其中化合物蘆丁、柚皮苷、染料木苷、染料木素、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素為地榆槐角丸中首次測(cè)定報(bào)道。

3.2檢測(cè)方法的選擇研究過程中曾嘗試采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)測(cè)定地榆槐角丸中9種成分的含量，由于9種待測(cè)化合物極性差別很大，加之有些成分在制劑中含量較低，高效液相測(cè)定要求化合物能達(dá)到完全的分離，紫外檢測(cè)器的靈敏度及選擇性往往達(dá)不到測(cè)定的要求，但液相色譜-質(zhì)譜具有靈敏度高、干擾少等優(yōu)點(diǎn)，故本研究選用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用作為待測(cè)化合物的檢測(cè)方法。

3.3流動(dòng)相的選擇為在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)被測(cè)化合物的有效分離，本研究考察了不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，如乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%乙酸水溶液、甲醇-0.1%乙酸酸水溶液梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%乙酸水溶液作流動(dòng)相使9種成分出峰較快，并可顯著改善峰型，提高靈敏度，故確定該系統(tǒng)為本研究流動(dòng)相。

3.4供試品提取方法的選擇本研究對(duì)比了加熱回流提取和超聲提取2種提取方法，結(jié)果顯示上述2種方法對(duì)提取效率無差異，故選擇相對(duì)簡(jiǎn)便的超聲法作為供試品提取方法。隨后比較了不同提取溶劑和提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，結(jié)果表明采用純甲醇超聲處理40 min時(shí)9種待測(cè)化合物特征峰的峰面積不再增加，即能達(dá)到最大的提取量，因此最后選定樣品1.0 g用50 mL 100%甲醇超聲處理40 min進(jìn)行供試品溶液的制備。

3.5溶液制備方法的選擇研究過程中發(fā)現(xiàn)供試品溶液以100%甲醇溶液進(jìn)樣時(shí)由于供試品溶液和流動(dòng)相洗脫能力的不匹配導(dǎo)致蘆丁和柚皮苷均產(chǎn)生了明顯的溶劑效應(yīng)，為了消除溶劑效應(yīng)對(duì)測(cè)定的影響，當(dāng)供試品溶液和對(duì)照品溶液制備時(shí)均采用50%的甲醇溶液進(jìn)行稀釋，溶劑效應(yīng)得到明顯改善。

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(本文編輯：許卓文)

·病例報(bào)告·

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[中圖分類號(hào)]R972.6

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2015)07-0745-05

[收稿日期]2014-11-05；[修回日期]2015-02-03

[作者簡(jiǎn)介]楊昱(1991-)，女，河北石家莊人,河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事糖尿病及其并發(fā)癥診治研究。

*通訊作者。E-mail:zhouyaru_hc@163.com

Simultaneous determination of nine constituents in Di-Yu-Huai-Jiao pill by LC-MS/MS

JIN Yi-ran1,2,TIAN Ting-ting1,HE Fan1,MA Ying-hua1,XU Hui-jun1,DU Ying-feng1*

(1.School of Pharmacy,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China；2.Department of

Pharmacy,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China)

[Abstract]ObjectiveTo develop a method for the simultaneous determination of rutin,sophoricoside,naringin,genistin,baicalin,genistein,aloe-emodin,rhein and emodin in Di-Yu-Huai-Jiao pill.Methods C18 column was used with the mobile phase of acetonitrile 0.1% aqueous acetic acid water with gradient elution.The identification and quantification of the analytes were achieved on multiple-reaction monitoring scanning(MRM) under negative ion scanning mode with electrospray ionization(ESI).ResultsThere were significant correlation between the ratio of peak area and the concentration of each compound within the test ranges.The average recoveries(n=3) of the nine compounds listed above were 96.2%，97.5%，98.3%，99.6%，97.5%，100.1%，94.2%，98.7% and 99.7%.The RSDs were 1.3%，1.2%，1.4%，1.7%，0.5%，0.54%，0.9%，1.0% and 0.8%,respectively.ConclusionThe method is simple,accurate and highly reproducible,and can be used for the determination of nine compounds in Di-Yu-Huai-Jiao pill.

[Key words]Di-Yu-Huai-Jiao pill;chromatography,liquid;tandem mass spectrometry;determination