鐘佳蕓，張 濤

1成都外國(guó)語(yǔ)學(xué)校；2成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系

重組鏈球菌溶血素(SLO)的原核表達(dá)、純化

鐘佳蕓1，張 濤2

1成都外國(guó)語(yǔ)學(xué)校；2成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系

目的構(gòu)建SLO原核表達(dá)質(zhì)粒，重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)并純化。方法提取鏈霉菌溶血素O模板DNA,PCR法擴(kuò)增slo基因。構(gòu)建融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-slo和pet32a-tev-slo，將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21和大腸桿菌BL21-DE3,使用異丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白。采用親和層析純化重組蛋白，切除標(biāo)簽后，再通過(guò)親和層析純化，獲取SLO重組蛋白。結(jié)果PCR擴(kuò)增出slo基因，基因片段（1700 bp）與理論一致。經(jīng)SDSPAGE,蛋白質(zhì)印跡顯示重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為55 kDa，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)果相符。結(jié)論成功構(gòu)建了slo原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)并純化了SLO重組蛋白。

鏈霉菌溶血素O；原核表達(dá)；蛋白質(zhì)純化

1 引言

鏈球菌溶血素是由A群鏈球菌產(chǎn)生的一種外毒素，能溶解紅細(xì)胞，并對(duì)機(jī)體多種細(xì)胞有毒性作用。鏈球菌溶血素主要有鏈球菌溶血素“O”(SLO)和鏈球菌溶血素“S”（SLS）兩種[1]。其中SLS多數(shù)是由A、C、G群鏈球菌產(chǎn)生，是一種小分子糖肽，不具有免疫原性，在養(yǎng)存在的條件下穩(wěn)定的存在，但是對(duì)熱和酸較為敏感。

鏈球菌溶血素“O”(SLO),基因大小為1700 bp左右，緊跟著spn基因。所表達(dá)的蛋白相對(duì)分子量為55 kDa,大部分是由A群鏈球菌產(chǎn)生的，SLO釋放前主要存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間的周圍包漿中[2]，在細(xì)菌的對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期釋放[3]，因此可以看出釋放SLO的鏈球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高。SLO蛋白的等電點(diǎn)為6.0-6.4，主要由十七種氨基酸組成，主要以天冬氨酸、賴氨酸以及谷氨酸為首，組氨酸和半胱氨酸以及脯氨酸較少，不存在酪氨酸。SLO是含有-SH的蛋白質(zhì)，因此具有強(qiáng)烈的異質(zhì)性，對(duì)氧十分的敏感，在氧存在的情況下-SH被氧化成-SS-基，暫時(shí)失去溶解細(xì)胞的功能，因此又被稱之為SH-激活細(xì)胞溶素，它通過(guò)與靶細(xì)胞膜表面相應(yīng)的膽固醇受體不可逆的相互作用，從而與靶細(xì)胞結(jié)合，單體發(fā)生寡聚化，形成環(huán)狀的前孔結(jié)構(gòu)，然后發(fā)生構(gòu)象改變，從而前孔插入膜中，最終在靶細(xì)胞膜上形成跨膜的大型兩性β-桶狀孔道，這一結(jié)構(gòu)賦予其“造孔”的特殊功能[4]。此桶裝孔道大約有25-30納米大小。溶紅細(xì)胞活性是SLO的特殊生物活性，以HU來(lái)表示，據(jù)推算一百個(gè)SLO分子可以溶解一個(gè)紅細(xì)胞。SLO的溶細(xì)胞效應(yīng)高度的依賴膽固醇。細(xì)胞膜上的膽固醇不僅是SLO的結(jié)合位點(diǎn)，也是其靶點(diǎn)[3,5]。SLO的溶細(xì)胞活性可以被鋅離子和鈣離子所抑制，鋅離子和鈣離子主要通過(guò)與SLO的琉基發(fā)生反應(yīng)，從而發(fā)揮抑制作用。SLO的抗原性極強(qiáng)，感染此種鏈球菌后2～3周內(nèi)，85%以上病人產(chǎn)生抗“O”抗體，病愈后可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，因此可作為新近鏈球菌感染。除此之外風(fēng)濕熱患者該抗體滴度較高，因此測(cè)定其含量可作輔助診斷。目前,血清抗鏈球菌溶血素O的測(cè)定已廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕病、急性腎炎等與鏈球菌感染有關(guān)疾病的診斷。

在對(duì)病人檢測(cè)是否患有風(fēng)濕病的時(shí)候，常檢測(cè)的是病人血清中ASO的含量。正常人的ASO值常在500 U以下，但當(dāng)患有風(fēng)濕病的時(shí)候，ASO的值明顯升高。因此測(cè)定ASO的含量對(duì)判定病人是否患有風(fēng)濕病是一個(gè)重要的指標(biāo)[6]。因而制備出高純度的檢測(cè)抗原SLO對(duì)制備ASO檢測(cè)試劑盒是有非常有研究意義的。

2 材料與方法

2.1材料

E.coil DH5α菌株、E.coli BL21-DE3菌株來(lái)自實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pET-32a-tev來(lái)自實(shí)驗(yàn)室保存,slo基因模板購(gòu)買自武漢華美生物技術(shù)公司，Bam H I和Xho I酶購(gòu)買自Fermentas，T4DNA聚合酶購(gòu)買自TaKaRa,DNA純化回收試劑盒購(gòu)買自TIANGEN，質(zhì)粒小抽提取試劑盒購(gòu)買自道普生物科技有限公司。

2.2方法

2.2.1 PCR獲取目的基因

以購(gòu)買自武漢華美公司的人源SLO基因作為模板，設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為GAATTC-CTTGCTCCTAAAGAAATGCC,下游引物序列為CTCGAG-TCACTTATAAGTAATCGAACC（傾斜字體表示BamHI與XhoI的酶切位點(diǎn)），以人源SLO基因作為模板進(jìn)行PCR，94℃30s，52℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)。

2.2.2載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoI分別酶切載體pET-32a-tev以及PCR產(chǎn)物，37℃酶切3h，將酶切后的質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收。將回收后的載體與PCR產(chǎn)物按1:3比例混合[7]，室溫放置10min,轉(zhuǎn)化DH5α，涂含有氨芐青霉素的平板，挑取單克隆提質(zhì)粒，送公司（華大基因）測(cè)序。

2.2.3重組蛋白的表達(dá)與純化[13]

將構(gòu)建好的，測(cè)序正確的重組載體轉(zhuǎn)化BL21-DE3，涂含有氨芐青霉素的平板，隨后挑取單克隆接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃,220rpm培養(yǎng)至OD600值為1.0左右時(shí)，加入IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，終濃度0.5mmol/L)，18℃誘導(dǎo)過(guò)夜，8000rpm離心15min收菌。

將收集的菌體用緩沖液A（20mM Tris-HCl,pH8.0+100 mM Na?Cl+10mM咪唑）重懸，用高壓均質(zhì)機(jī)（AVESTIN,）15000psi破四遍，4℃條件下20000rpm離心30min。離心后上清與沉淀經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)，蛋白以可溶形式存在。收集上清，過(guò)膜（0.22μm），表達(dá)載體pET-32a-tev，帶有組氨酸標(biāo)簽，表達(dá)的目的蛋白前端含有TEV的酶切位點(diǎn)。過(guò)膜后上清，用蛋白純化儀（AKTA explorer100, GE Healthcare）過(guò)親和層析柱（HisTrap HP 5ml,GE Healthcare），用緩沖液B（20mM Tris-HCl+pH8.0+100mM NaCl+500mM咪唑）梯度洗脫。采用SDS-PAGE以及Western-blot對(duì)純化蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.4 TEV酶切去除標(biāo)簽

用TEV酶切割重組蛋白His-tev-SLO使標(biāo)簽蛋白His與目的蛋白SLO分開。將上述純化好的SLO重組蛋白用0.02 mol/L PB，pH 8.0磷酸鹽緩沖液透析以去除以前純化的蛋白中的咪唑和高濃度氯化鈉。按1 mg TEV酶切割100 mg目的蛋白的比例加入TEV酶，4℃冰箱酶切過(guò)夜。SDS-PAGE以及Western-blot檢測(cè)標(biāo)簽去除。

3 結(jié)果分析

3.1目的基因PCR擴(kuò)增及重組載體鑒定結(jié)果

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示slo基因片段為1700 bp左右，與理論DNA表達(dá)片段大小一致（圖1a）。將擴(kuò)增得到的slo基因片段pET-32a-tev質(zhì)粒分別經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接后得到的重組質(zhì)粒再次雙酶切鑒定，結(jié)果顯示在1700 bp處存在特異性片段（圖1b）,構(gòu)建好的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與NCBI登陸序列一致。

3.2蛋白純化結(jié)果

用蛋白純化儀過(guò)親和層析柱，高濃度咪唑梯度洗脫，在咪唑濃度為100mM-200mM之間時(shí)出峰，12%SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，可以獲得純度較高的重組SLO蛋白（見圖3），在70KD處有明顯的單一目的條帶，經(jīng)親和層析純化后，

圖1 PCR及雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 The Results of PCR and double restriction endonuclease M為DNA marker

每升菌液可以獲得大約30mg的重組SLO蛋白，將純化后的重組蛋白透析后，用TEV酶切，再次經(jīng)過(guò)親和層析出去His標(biāo)簽，得到純度較高的重組蛋白（圖2）。

圖2 His-tev-SLO純化Fig.2 Purified of His-tev-SLO

M：Protein maker；

1：His-tev-SLO陰性對(duì)照（未加IPTG誘導(dǎo)）；2：His-tev-SLO上清；3：His-tev-SLO純化；4：His-tev-SLO融合蛋白酶切；5：純化后的SLO；

3.3 Western blotting驗(yàn)證

純化后SLO蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分析后進(jìn)行蛋白印跡鑒定，可見在相對(duì)分子質(zhì)量約為55 kDa處出現(xiàn)特異性雜交帶，表明為SLO蛋白（圖3）。

圖3 SLO免疫印記Fig.3 Western blottingof SLO預(yù)染Marker 1:對(duì)照2：實(shí)驗(yàn)

4.討論

本文通過(guò)對(duì)SLO原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化的研究表明：PCR擴(kuò)增出的slo基因片段(1700 bp)與理論大小一致。測(cè)序結(jié)果證明pET-32a-tev-slo重組表達(dá)質(zhì)粒無(wú)缺失和突變。SDS-PAGE和Western blot分析經(jīng)TEV酶酶切后的His-tev-SLO后純化的SLO的相對(duì)分子質(zhì)量為55 kDa，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果相符。Histev-SLO重組融合蛋白經(jīng)過(guò)酶切去標(biāo)簽得到了目的蛋白SLO。

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