劉梁，孫維礦，趙玲，李赫宇，陳新，*

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

響應(yīng)面法優(yōu)化米糠蛋白的酶解工藝

劉梁1，孫維礦1，趙玲1，李赫宇2，陳新1，*

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

通過單因素試驗及響應(yīng)面分析法，對米糠蛋白酶解制備抗氧化性米糠肽的工藝進行優(yōu)化。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件，以酶解時間、溫度、pH為自變量，以酶解后樣品對超氧陰離子自由基清除率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理，研究3個自變量及其交互作用對樣品的超氧陰離子自由基清除率的影響。通過不同酶對米糠蛋白的水解度試驗，確認堿性蛋白酶為最高效水解酶，在此前提下，響應(yīng)面優(yōu)化的最佳酶解條件為：酶解溫度50℃，酶解時間4.5 h，pH 10，此條件下，超氧陰離子自由基清除率實際值為40.27%。米糠肽的相對分子質(zhì)量分布測定結(jié)果表面米肽相對分子質(zhì)量分布在142u～21 281 u之間。

響應(yīng)面法；抗氧化性；米糠蛋白；酶解

抗氧化劑的種類很多，然而隨著人們對化學合成的抗氧化劑如BHA、BHT在食品中應(yīng)用的要求越來越嚴格，人們把目光逐步轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑，從各種植物動物組織中提取，如茶葉中的茶多酚、大豆中的大豆異黃酮、骨骼肌中的肌肽、枸杞中的枸杞多糖、大豆蛋白分解得到的大豆肽以及慈菇、扇貝、六月霜的提取物等[1]。具有抗氧化性質(zhì)的多肽類物質(zhì)一般稱為抗氧化活性肽[2]。目前，抗氧化活性肽的獲得途徑主要有三種。第一種方法是從天然植物體中提取天然活性肽，這種方法提取成本高；第二種方法是通過消化過程中產(chǎn)生或水解蛋白而產(chǎn)生，一般采用酸法水解蛋白，其工藝簡單、成本低，但因氨基酸受損嚴重，水解難控制而較少應(yīng)用；第三種方法是通過化學方法、酶法、重組技術(shù)合成[3-5]。酶法生產(chǎn)的產(chǎn)品安全性高，生產(chǎn)條件溫和，可定位生產(chǎn)特定的肽，且成本低，已成為活性肽最主要的生產(chǎn)方法[6]。目前已采用酶法研究出多種植物性多肽，如從玉米中得到降血壓肽、高值寡肽和活性肽，從花生中得到花生肽等[7-8]。米糠是大米加工的副產(chǎn)品，是糙米碾白過程中被碾下的皮層及少量米胚和碎米的混合物，聯(lián)合國工業(yè)發(fā)展組織把米糠稱為一種未充分利用的原料[9]。米糠肽是通過酶法水解米糠蛋白制備的一種生物活性肽[10]。本文基于米糠蛋白水解度篩選酶解酶種；以抗氧化性為指標，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化米糠蛋白制備抗氧化活性肽的酶解工藝，為米糠抗氧化肽資源的最大效益化利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

米糠蛋白（水分9.6%，蛋白質(zhì)70.96%，脂肪2.22%，灰分2.53%）：湖北洪森集團；堿性蛋白酶（酶活6 000 u/mg）、酸性蛋白酶（酶活6 000 u/mg）、中性蛋白酶（酶活6 000 u/mg）：合肥博美生物科技有限責任公司；復合蛋白酶（Protamex）、風味酶（Flavourzyme）：Novo Nordisk公司；三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉、鹽酸、三氯乙酸和三氯化鐵：天津市大茂化學試劑。

1.2 儀器和設(shè)備

PHS-2C型精密酸度計：上海雷磁儀器廠；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；LXJ-Ⅱ型離心沉淀機：上海醫(yī)用分析儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)公司；電熱恒溫水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；752N型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；Waters 600液相色譜：Waters公司；AL204-01電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；835-50氨基酸自動分析儀：日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 水解度為指標進行酶種的選擇

不同蛋白酶水解米糠蛋白：分別采用堿性蛋白酶、風味酶、中性蛋白酶和復合酶四種蛋白酶水解米糠蛋白250min，米糠蛋白以10%濃度溶解在200mL去離子水中，水解條件分別是：①堿性蛋白酶：pH 9.0，[E]/[S]48 AU/kg，45℃；②中性蛋白酶：pH 7.0，[E]/[S] 20AU/kg，50℃；③中性蛋白酶：pH 7.0，[E]/[S]10000LAPU/ kg，45℃；④復合蛋白酶：pH7.0，[E]/[S]30AU/kg，45℃。水解結(jié)束后立即把酶解液放入95℃以上熱水中15 min中止酶解反應(yīng)，滅酶后的水解液冷卻至室溫，用2mol/LNaOH調(diào)pH 7.0，10 000 r/min冷凍離心20min，上清液經(jīng)濃縮后冷凍干燥備用。

蛋白質(zhì)水解度（DH）的測定：在中性及堿性條件下采用pH-stat法，水解度的計算公式為：DH（%）=B× Nb×1/α×1/MP×1/htot×100%。式中∶B為堿液體積，mL； Nb為堿液的當量濃度，（mol/L）；α為α-氨基的解離度（根據(jù)具體情況而定）；MP為底物中蛋白質(zhì)的含量，g；Htot為底物蛋白質(zhì)中的肽鍵總數(shù)，（mmol/g）；試驗采用米糠白為原料，取htot=8.40。

1.3.2 抗氧化性為指標進行酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化

1.3.2.1 酶解工藝中單因素實驗

酶解pH：本試驗酶解pH分別選擇為7、8、9、10、11、12，在酶解時間120min，在鹽酸濃度為2mol/L，酸解液料比為1 m L/mg，酶解溫度50℃的條件下，計算米糠蛋白水解物對超氧自由基的清除率。

酶解溫度：本試驗酶解溫度分別選擇為40、45、50、55、60、65℃，酶解時間120min，鹽酸濃度為2mol/L，酸解液料比為1mL/mg，計算米糠蛋白水解物超氧自由基清除率。

酶解時間：本試驗酶解溫時間分別選擇為3、4、5、6、7、8 h，在鹽酸濃度為2mol/L，酸解液料比為1mL/mg，酶解溫度為50℃，計算米糠蛋白水解物超氧自由基清除率。

1.3.2.2 酶解工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

分析上述單因素實驗數(shù)據(jù)，根據(jù)單因素實驗得出的各因素最適范圍，對酶解溫度、pH、酶解時間3個因素設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以超氧自由基清除率為指標確定最佳酶解條件。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除能力測定方法

pH 8.2，濃度50mmol/L的Tris-HCl緩沖液2.8mL中加入0.1 mL蒸餾水，于25℃保溫10min，然后加入0.1mL于25℃預(yù)溫的60mmol/L連苯三酚（空白管樣品用0.1mL，10mmol/L的鹽酸代替，測樣品用0.1mL，50mmol/L提取液），總體積為3.0m L，在420 nm處測得總吸光度為A1，樣品吸光度A2，空白對照吸光度A3。O2-清除率/%=A1-（A2-A3）/A1×100%。

1.3.2.4 米糠肽相對分子質(zhì)量分布測定

采用Waters600（配2487紫外檢測器和M32工作站）高效液相色譜儀，選擇Tskgel G2000SW×L相對分子質(zhì)量分級范圍100Da～10 000Da的色譜柱，以乙腈/水/三氟乙酸（45/55/0.1體積比）為洗脫液，以細胞色素C（Mw12500）、抑肽酶（Mw6500）、桿菌酶（Mw1450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（Mw451）和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（Mw189）為相對分子質(zhì)量標準品。流動相為乙晴/水/TFA 45/55/0.1，檢測波長為220 nm，流速0.5mL/min，柱溫為30℃。

1.3.2.5 米糠蛋白和米糠肽的氨基酸組成分析

將樣品置于水解管中，加入6mol/L的鹽酸溶液，真空封口。在110℃下水解24 h，冷卻后定容、過濾、蒸干，加入0.02mol/L的鹽酸溶液，放置30min，采用氨基酸自動分析儀測定除色氨酸以外的氨基酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白酶對米蛋白的水解進程曲線

蛋白酶在水解蛋白質(zhì)時，對底物有特異性要求（見表1）。不同蛋白酶作用于同一種蛋白質(zhì)，會產(chǎn)生不同的酶解產(chǎn)物，分別選用堿性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶和中性蛋白酶對米蛋白進行水解，根據(jù)氫氧化鈉的用量，由公式計算出不同時間的水解度，繪成圖形見表1。

表1 四種蛋白酶的底物特異性Table1 The substrate specificity of four proteases

表1中數(shù)據(jù)顯示，堿性蛋白酶對米蛋白的水解效果明顯好于其他三種蛋白酶。堿性蛋白酶作用范圍廣，對疏水性氨基酸-COOH具有底物特異性，從水解進程曲線來看，堿性蛋白酶對米蛋白有較好的水解作用，遠比其他幾種蛋白酶的水解作用強，主要是因為堿性蛋白酶的純度和活力較高。中性蛋白酶主要作用于苯丙氨酸和色氨酸-COOH參與形成的肽鍵，對米糠蛋白的作用非常弱，反應(yīng)240min后水解度僅為7.0%。復合蛋白酶和風味酶雖然作用范圍廣，但在此條件下對米糠蛋白作用也較弱，復合蛋白酶對米糠蛋白的作用稍強可能是前者純度和活性較高或?qū)Φ孜锏奶厥庖蟛煌斐?。根?jù)試驗結(jié)果，選用堿性蛋白酶水解米糠蛋白，并對其水解條件進一步優(yōu)化研究。

圖1 不同蛋白酶對米蛋白的水解進程Fig.1 The hydrolysis process of rice protein in different protease

2.2 抗氧化性為指標進行酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 水解工藝單因素試驗

酶解溫度對米糠水解物抗氧化活性影響：本試驗酶解溫度分別選擇為40、45、50、55、60、65℃，在酶解時間120 min，鹽酸濃度為2 mol/L，酸解液料比為1 mL/mg的條件下，計算米糠蛋白水解物對超氧自由基的清除率。堿性蛋白酶酶解米糠蛋白在不同溫度下酶解物的超氧自由基清除能力如圖2所示。

圖2 酶解溫度（A）、時間（B）、pH（C）對米糠水解物抗氧化活性影響Fig.2 The influence of reaction conditions on the antioxidant activity of rice bran hydrolysate.A（T），B（Time），C（pH）

隨著酶解溫度的升高，米糠肽抗氧化活性逐漸增強，55℃時米糠多肽對超氧自由基的清除效率都達到最高。溫度對酶催化反應(yīng)的影響，主要體現(xiàn)在酶穩(wěn)定性和酶促反應(yīng)上。一定的溫度變化范圍內(nèi)，溫度上升加快了反應(yīng)速度，使超氧自由基的清除效果增強，并在55℃達到最大。繼續(xù)升高溫度，超氧自由基的清除效果明顯降低，這是因為溫度過高導致酶活性降低，多肽中抗氧化活性基團暴露相對減少。故選擇酶解溫度為55℃。

酶解時間對米糠蛋白水解物抗氧化活性影響：本試驗酶解溫時間分別選擇為3、4、5、6、7、8 h，在鹽酸濃度為2 mol/L，酸解液料比為1 mL/mg，酶解溫度為50℃的條件下，計算米糠蛋白水解物對超氧自由基的清除率。堿性蛋白酶酶解米糠蛋白在不同酶解時間下酶解物的超氧自由基清除能力變化如圖2所示。隨著酶解時間的延長，米糠蛋白水解物對超氧自由基的清除率緩慢上升后又趨逐漸于平緩。由此得出，酶解時間對米糠水解物超氧自由基清除率效果的影響很小。為了節(jié)約成本，選擇酶解時間4 h為最佳。

酶解pH對米糠水解物抗氧化活性影響：本試驗酶解pH分別選擇為7、8、9、10、11、12，在酶解解時間120min，鹽酸濃度為2mol/L，酸解液料比為1mL/mg，酶解溫度50℃的條件下，計算米糠蛋白水解物對超氧自由基的清除率。堿性蛋白酶酶解米糠蛋白在不同酶解pH下酶解產(chǎn)物的超氧自由基清除率變化如圖2所示。pH在6到10范圍內(nèi)，米糠蛋白水解產(chǎn)物對超氧自由基的清除效果逐漸增強，pH為10時，米糠水解產(chǎn)物對超氧自由基清除效果達到最大。當pH大于10時，超氧自由基清除率逐漸降低，說明pH過大或過小都會抑制堿性蛋白酶的酶解活性。堿性蛋白酶對pH值的適應(yīng)性，可能與其酶活性中心含有的羧基有關(guān)。酶的最適pH會受到各種因素的影響，如底物的濃度、種類及所處環(huán)境等，所以最適pH只有在一定條件下才有意義。故選擇最佳pH為10。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計試驗之中心組合試驗Box-Behnken設(shè)計方案。以超氧自由基清除率為指標，優(yōu)化米糠水解物活性成分抗氧化最佳提取工藝。選定顯著影響超氧自由基清除效果的三個因素：酶解溫度、酶解時間、酶解pH，為參考因素，分別以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，對自變量進行編碼，見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗因素與水平Table2 Variables and levels in Box-Behnken in design expert

2.2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

采用Design-Expert.v8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行線性擬合和方差分析，考察因素顯著性，根據(jù)回歸方程，響應(yīng)面曲線圖，等高線圖，分析各因素交互作用的顯著性，得出試驗結(jié)果，見表3。

通過分析表3，可得各因素與超氧自由基清除率的二次多項式模型Y=38.24+2.43A-0.41B+2.86C-1.15AB-1.65AC-0.23BC-4.56A2-2.23B2+1.62C2。式中，Y為超氧自由基清除率的預(yù)測值，A、B、C分別代表-酶解溫度，酶解時間，酶解pH的編碼值，見表4。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 The results in Box-Behnken in design expert

表4 擬合二次多項式模型的方差分析Table4 The quadratic multinomial variance analysis of the model

由表4可以看出：A、C、AC、AB、A2、B2、C2因素對米糠水解物超氧陰離子自由基清除率有顯著的作用。清除效果顯著性大小依次為C>A>B。F檢驗反應(yīng)的是回歸模型的有效性，方程復相關(guān)系數(shù)的平方R2= 0.991 4，說明該模型顯著性好，失擬性大于0.05差異不顯著，說明方程誤差小。Radj2=0.980 3，說明軟件建立的模型能夠反映98.03%響應(yīng)值的變化，較好反映提取條件對米糠水解物超氧陰離子自由基清除率大小變化規(guī)律，故用響應(yīng)面法優(yōu)化該工藝。

2.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗分析

由方程作響應(yīng)面曲面圖如圖3所示。

圖3 酶解反應(yīng)條件參數(shù)相互作用響應(yīng)面曲面圖；A，溫度與pH；B，時間與pH；C，溫度與時間Fig.3 The response surface image of reaction condition parameters.A，pH and temperature、B，Time and pH、C，Temperature and time.

（1）本試驗中酶解溫度與pH相互作用極其顯著（P=0.000 6<0.01），將酶解時間固定在零水平，可以得到酶解溫度與pH相互作用結(jié)果對米糠水解物超氧陰離子自由基清除率大小影響極大；（2）酶解時間與pH相互作用不是很顯著（P=0.074 3>0.05），將酶解溫度固定在零水平，可以得到酶解時間與pH相互作用結(jié)果對米糠水解物超氧陰離子自由基清除率大小影響一般；（3）酶解時間與酶解溫度相互作用極為顯著（P= 0.004 4<0.01），將pH固定在零水平，可以得到酶解時間與酶解溫度相互作用結(jié)果對米糠水解物超氧陰離子自由基清除率大小影響極大。

2.2.2.3 米糠肽超氧陰離子自由基清除率的響應(yīng)面分析與優(yōu)化結(jié)果討論

通過酶解溫度（A）、酶解時間（B）、pH（C）及其交互作用對米糠水解物的超氧陰離子自由基清除率的影響分析得出：pH對米糠水解物超氧陰離子自由基清除率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；酶解溫度對米糠超氧陰離子自由基清除率的影響也十分顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；而酶解時間相應(yīng)表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值沒有顯著性變化。在酶解時間（B）值為0水平時，酶解溫度（A）、pH（C）有著明顯的交互作用，在pH（C）值為1水平時，酶解時間（B）為0水平，酶解溫度（A）為0水平時，響應(yīng)值達到最大值。

通過響應(yīng)面優(yōu)化米糠水解物超氧陰離子自由基清除效果最佳酶解工藝條件：酶解溫度52.71℃，酶解時間4.37 h，pH 9.94。在此條件下，超氧陰離子自由基清除率預(yù)測值40.7225%。為了檢驗響應(yīng)面設(shè)計試驗可靠性，根據(jù)實際的操作條件對酶解最佳工藝進行修正：酶解溫度50℃，酶解時間4.5 h，pH10，在此條件下，超氧陰離子自由基清除率實際值40.273 5%。實際值與預(yù)測值差異較小，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的酶解工藝條件可靠。

2.2.2.4 米肽相對分子質(zhì)量分布的測定

圖4是米肽的體積排阻高效液相色譜圖，回歸方程是lgMw=7.24-0.242T，相關(guān)系數(shù)R=0.995 0，表明各相對分子質(zhì)量對數(shù)與各標樣的洗脫時間成很好的相關(guān)性，可以準確地測定米肽的相對分子質(zhì)量分布。

圖4 米糠肽的SE-HPLC圖譜Fig.4 The SE-HPLC spectra of rice bran peptides

從圖4中可以看出，米肽的相對分子質(zhì)量分布在142 u～21 281 u之間，主要集中在142 u～1413 u之間，其具體的分布情況見表5所示。

從表5中可以看出，相對分子質(zhì)量分布在142 u～329 u之間的肽含量最高，為34.21%；其次是相對分子質(zhì)量分布在329 u～738 u和738 u～141 3u之間的肽，含量分別為27.80%和12.39%；相對分子質(zhì)量分布在1 413 u～2 836 u和2 836 u～2 1281 u之間的肽最少，含量分別為6.96%和5.42%。結(jié)合抗氧化功能條件的篩選結(jié)果，說明本條件酶解可得到具有較好的抗氧化活性短肽肽，由于目前所發(fā)現(xiàn)具有特殊生理功能的肽類物質(zhì)其相對分子質(zhì)量一般在1 000 u以下，與本實驗結(jié)果一致。

表5 米糠肽的相對分子質(zhì)量分布Table5 Molecular weight distribution of rice bran peptides

2.2.2.5 米肽和米蛋白的氨基酸組成

米肽和米蛋白的氨基酸組成見圖5。

圖5 米糠肽和米糠蛋白的氨基酸組成Fig.5 Amino acid composition of rice bran peptides and protein

圖5表明，米肽的氨基酸組成跟米蛋白差別不大。氨基酸分布較均勻，谷氨酸含量最高，為16.35%；其次為精氨酸和天冬氨酸及亮氨酸，分別為11.09%、9.46%和7.06%，四種氨基酸含量之和為45%左右；絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸，含量之和為35%左右。

3 結(jié)論

以水解度為指標，研究了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶和風味酶對米蛋白的水解作用，結(jié)果表明堿性蛋白酶對米蛋白的水解作用最強，其次為中性蛋白酶和復合蛋白酶，風味酶作用最弱，因此選定堿性蛋白酶水解米蛋白制備米肽。以抗氧化性為指標，利用響應(yīng)面回歸分析法對米糠中水解物超氧陰離子自由基清除實驗條件進行了研究，著重考察了pH、溫度及提取時間3個因素對米糠中活性肽超氧陰離子自由基清除率的影響，通過響應(yīng)面優(yōu)化米糠肽超氧陰離子自由基清除效果最佳酶解工藝條件：酶解溫度52.71℃，酶解時間4.37 h，pH9.94。根據(jù)實際對試驗條件進行修正得到試驗最佳條件為：酶解溫度50℃，酶解時間4.5 h，pH10，在此條件下，超氧陰離子自由基清除率實際值40.27%。氨基酸組成分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)米肽的氨基酸組成跟米蛋白類似，因此米肽可以在食品中廣泛使用。米肽的相對分子質(zhì)量分布測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，米肽相對分子質(zhì)量分布在142 u～21 281 u之間，主要集中在142 u～1 413 u之間，而具有特殊生理功能的肽類物質(zhì)其相對分子質(zhì)量一般在1 000 u以下。

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Optim ization of the Enzymolysis Technology of Rice Bran Protein by Response Surface Methodology

LIU Liang1，SUN Wei-kuang1，ZHAO Ling1，LI He-yu2，CHEN Xin1，*
（1.School of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China；2.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

The enzymolysis technology of the protein from rice bran was optimized by the single factor experiment combined with response surface methodology.On the basis of single factor experiments，enzymatic hydrolysis time，temperature，pH were set as the argument value，and the rate of superoxide anion free radical scavenging by enzymolysis sample was set as the response value.According to the Box-Benhnken central composite design theory，the influence of three independent variables and their interactions on the superoxide anion free radical scavenging rate was studied.The alkaline protease was confirmed the most efficient hydrolase through the hydrolysis of different enzymes test.The optimum technology was confirmed by response surface methodology：extraction time 4.5 h，enzymolysis temperature 50℃and pH 10.Under these conditions，the superoxide radical scavenging rate of rice bran protein was 40.27%.And the molecular weight of rice bran peptide was between 142 u-21 281 u.

response surface methodology；antioxidant activity；rice bran protein；enzymolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.019

2014-11-28

劉梁（1981—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品功能因子研究。

*通信作者