孫玉玉，孫浩，*，董振霖，高術(shù)杰，杜茂

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116001；3.江西省食品發(fā)酵研究所，江西宜春336000；4.河北省石家莊市鹿泉區(qū)農(nóng)產(chǎn)品綜合質(zhì)檢站，河北石家莊050200）

QuEChERS-GC-MSMS法測定大米中20種農(nóng)藥殘留

孫玉玉1，孫浩1，*，董振霖2，高術(shù)杰3，杜茂4

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116001；3.江西省食品發(fā)酵研究所，江西宜春336000；4.河北省石家莊市鹿泉區(qū)農(nóng)產(chǎn)品綜合質(zhì)檢站，河北石家莊050200）

建立一種簡便、快速、靈敏可同時測定大米中20種農(nóng)藥殘留的分析方法。采用乙腈溶液提取大米樣品中的農(nóng)藥，經(jīng)QuEchERs方法凈化，采用氣相色譜分離，多反應監(jiān)測（MRM）模式進行測定。通過保留時間、選擇離子及其相對豐度定性，外標法定量。結(jié)果表明，20種農(nóng)藥的線性范圍為0.01μg/mL～0.2μg/m L，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，大多數(shù)農(nóng)藥的加標回收率在70%～120%之間，相對標準偏差小于20%。

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）；大米；QuEChERS；農(nóng)藥殘留

食品中的農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為人們越來越關(guān)注的現(xiàn)象，因為根本沒有辦法在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)過程不使用農(nóng)藥。農(nóng)藥在防治病蟲害，去除雜草，控制人畜傳染病，提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量等方面起著積極作用，但隨著農(nóng)藥的大量及不合理的使用，食品中的農(nóng)藥殘留對人類健康造成的負面影響也日益顯露出來[1]。

大米是人類的主要糧食之一，在人們食品消費中占有很大的比例。為了保證水稻的產(chǎn)量，延長大米的貯存時間，在其生長以及儲藏過程中施用大量的化學農(nóng)藥，不僅造成環(huán)境污染而且直接影響大米的食用安全，威脅人們的健康[2]。隨著人們對食品安全意識的提高，大米中農(nóng)藥殘留的檢測越來越引起人們的關(guān)注。國內(nèi)外對大米的農(nóng)殘檢測方法研究很多[3-6]，但對多品種農(nóng)藥殘留檢測方法的研究卻很少。

2003年Anastassiades和Lehotay[7]開發(fā)出了一種新的，主要應用于果蔬樣品前處理的方法，這種方法由于其快速（quick）、簡單（easy）、廉價（cheap）、高效（effective）、耐用（rugged）、安全（safe），所以被命名為QuEChERS。2005年到2007年Lehotay等[8-9]又對該方法進行了改進，使該方法不僅適用于水果蔬菜的前處理，也開拓了在糧谷等含油量較高食品的前處理中的應用。

本論文的研究內(nèi)容主要是，采用乙腈溶液提取大米樣品中的農(nóng)藥，經(jīng)QuEchERs方法凈化，通過氣相色譜分離，多反應監(jiān)測（MRM）模式進行測定，通過保留時間、選擇離子及其相對豐度定性，外標法定量，來建立一種簡便、快速、靈敏可同時測定大米中20種農(nóng)藥殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

農(nóng)藥標準品：克草敵、氟丙嘧草酯、氯甲酰草胺、溴丁酰草胺、二丙烯草胺、苯胺靈、九氯、六氯苯，購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。環(huán)庚草醚、酞菌酯、氯酞酸甲酯、滅藻醌、毒草胺、乳氟禾草靈、炔苯酰草胺、二甲草胺、四溴菊酯、莠滅凈、撲滅津、戊環(huán)唑，購于美國Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH公司。農(nóng)藥標準品純度均大于98%。

乙腈、丙酮（色譜純）：美國Fisher公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）粉末（BONDESIL-PSA，40 UM）：美國瓦里安公司；C18粉末（Octadecyl，40μm）：美國J.T. Baker公司；無水硫酸鎂、NaCl（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。無水硫酸鎂在650℃下灼燒4 h，冷卻至120℃后，置干燥器中備用。

1.1.2 主要儀器

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（GC-MS/MS）：美國Thermo公司，配電子轟擊源（EI）；均質(zhì)機（T25 digital ULTRATURRAX）：德國IKA公司；電子天平（AE260）：瑞士梅特勒公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R215-PROV-V700）：英國BIBBY公司；離心機（Z-323k）：德國赫默公司；手掌型離心機（Sigma1-14）：德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5MS石英毛細管柱，30m×0.25mm（內(nèi)徑），膜厚0.25μm；載氣：氦氣，純度≥99.995%，1.0mL/min；色譜柱溫度：70℃保持1min，以15℃/min上升至230℃，再以30℃/min上升至280℃，保持10 min；進樣口溫度：250℃；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜接口溫度：250℃；進樣量：1μL；進樣方式：無分流進樣，1.0min后開閥；電離方式：EI；電離能量：70 eV；測定方式：多反應監(jiān)測方式（MRM）；監(jiān)測離子（m/z）：監(jiān)測離子分組見表1；溶劑延遲：3min。

1.2.2 標準溶液配制

標準儲備液的配制：準確稱取20種農(nóng)藥標準品各10mg（精確至0.1mg）分別置于10m L容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000μg/mL的農(nóng)藥標準儲備液，避光4℃冷藏保存。

混合標準儲備液的配制：各取250μL上述1000μg/m L單標準儲備液于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，即配制成質(zhì)量濃度為2.5μg/mL的混合標準儲備液，避光4℃冷藏保存。使用時用丙酮稀釋混合工作儲備液至一定濃度進行試驗條件的優(yōu)化。

混合基質(zhì)標準工作溶液的配制：農(nóng)藥殘留通過儀器檢測的響應信號強弱與其存在的基質(zhì)種類有關(guān)，采用氣相色譜分離檢測的農(nóng)藥往往表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應[10]。為避免基質(zhì)效應，配制基質(zhì)標準工作液作為定量依據(jù)。用空白樣品基質(zhì)作為溶劑，配制成濃度分別為0.01、0.025、0.05、0.1μg/mL和0.2μg/mL的混合基質(zhì)標準工作溶液，制備標準工作曲線。

1.2.3 提取

稱取10.0 g（精確至0.1g）磨碎的大米（過20目篩）至50 m L離心管中，加入10 m L高純水，浸泡30 min后加入15mL乙腈、4 g無水MgSO4和1 g NaCl，手搖3min，離心（4 000 r/min，5min）。

1.2.4 凈化

在2mL離心管中加入50mg PSA、50mg C18粉末和150mg無水MgSO4，精確取出上述提取液1mL（乙腈層）加入至離心管中，振蕩混合1 min后離心（4 000 r/min，5min），取上清液至自動進樣瓶中，供GC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 樣品的提取

由于同時檢測的農(nóng)藥品種較多，極性差異較大，而且部分農(nóng)藥在大米樣品中能與脂類物質(zhì)結(jié)合，不易分離，提取溶劑需滲入組織內(nèi)部才能得到良好的提取效果，因而對樣品的前處理要求較高。大米為干樣品，提取前需加入水使其充分浸潤，以保證提取劑與樣品充分接觸。乙腈、丙酮和乙酸乙酯均是常用的分析農(nóng)藥的提取劑，但丙酮和乙酸乙酯提取的共萃物中油脂含量較高，不利于凈化。乙腈提取色素和基質(zhì)中的蠟質(zhì)、脂肪等非極性成分的能力相對較小，而且更容易通過鹽析作用除去樣品中的水分，故本方法采用乙腈作為提取溶劑。提取時加入氯化鈉，有利于提取體系中水與乙腈的分層；加入無水硫酸鎂可進一步除水，而且無水硫酸鎂吸水的同時放熱，使提取體系的溫度升高更利于農(nóng)藥萃取。

2.1.2 樣品的凈化

樣品凈化加入PSA能夠吸附許多極性基質(zhì)成分，如脂肪酸、親脂性色素和糖類等，對農(nóng)藥殘留物無吸附作用；C18材料的硅膠上接有十八烷基，有較高的相覆蓋率和碳含量，對非極性物質(zhì)有較高的容量，可吸附油脂和其它一些非極性的雜質(zhì)，同時C18對各種農(nóng)藥化合物幾乎沒有吸附。脫水劑選擇無水硫酸鎂和氯化鈉，其原理是通過鹽析加速水相與有機相的分層。

2.2 基質(zhì)效應的確定

氣相色譜-質(zhì)譜方法開發(fā)和確證過程中需要對基質(zhì)效應作出評價。本文通過配置標準工作曲線和基質(zhì)匹配校正曲線，以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標作圖，以基質(zhì)匹配校正曲線與標準曲線的斜率的比值來考察各種農(nóng)藥化合物的基質(zhì)效應。一般認為，基質(zhì)匹配校正曲線斜率與標準曲線斜率的比值在85%～115%之間不存在基質(zhì)效應[11]。實驗結(jié)果表明，二丙烯草胺、莠滅凈和環(huán)庚草醚的基質(zhì)匹配校正曲線斜率與標準曲線斜率的比值大于115%，而克草敵、氯酞酸甲酯、氯甲酰草胺、乳氟禾草靈、氟丙嘧草酯、和四溴菊酯的基質(zhì)匹配校正曲線斜率與標準曲線斜率的比值小于85%，存在基質(zhì)效應。因此本文選用基質(zhì)匹配標準溶液校準方法來準確定量。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

三重四極桿質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括選擇母離子、子離子、碰撞能量、掃描時間等幾個方面[12]。通過查找儀器公司農(nóng)藥庫中的多反應監(jiān)測條件，得到部分農(nóng)藥的多反應監(jiān)測條件。其他未找到監(jiān)測條件的農(nóng)藥，進行20種混合農(nóng)藥標準儲備液（2.5μg/mL）全掃描，根據(jù)全掃描質(zhì)譜圖中的碎片離子選擇豐度相對較高、分子質(zhì)量較大的碎片離子作為母離子，然后對每個母離子進行碰撞能優(yōu)化，同時根據(jù)其子離子掃描質(zhì)譜圖，選取最佳的定性和定量離子對。每種農(nóng)藥的離子對和碰撞能，優(yōu)化后見表1。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關(guān)系

在確定的實驗條件下，用陰性樣品空白溶液與混 合農(nóng)藥標準儲備液配制成濃度分別為0.01、0.025、0.05、0.1μg/mL和0.2μg/mL的農(nóng)藥基質(zhì)標準溶液，以峰面積（y）對相應的20種不同農(nóng)藥的質(zhì)量濃度（x，μg/mL）做標準曲線，得到線性范圍和線性相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：所測定的20種混合農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與對應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99，具體數(shù)據(jù)見表2。

表1 多反應監(jiān)測模式下20種農(nóng)藥的保留時間、監(jiān)測離子對、碰撞能量和混合標準溶液的濃度Table1 Retention time，monitoring ion pairsand collision energiesand the concentration ofm ixed standard solution of 20 pesticidesundermultiple reactionmonitoring（MRM）mode

表2 多反應監(jiān)測模式下20種農(nóng)藥的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、平均回收率和相對標準偏差（n=6）Table2 Linear ranges，correlation coefficients（r2），spiked recoveries and RSDs of 20 pesticides under multiple reaction monitoring（MRM）mode（n=6）

2.4.2 方法的檢出限及定量限

檢出限（LOD）和定量限（LOQ）采用向空白樣品中逐級降低加標濃度的方法來確定[13]。以3倍信噪比（S/ N=3）對應的目標物濃度作為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）對應的目標物濃度作為定量限。20種農(nóng)藥中，除二丙烯草胺和四溴菊酯的LOQ為10μg/kg外，其他18種農(nóng)藥的LOQ均小于5μg/kg。滿足美國、歐盟、“日本肯定列表”及有關(guān)國家對這20種農(nóng)藥最高殘留限量（MRLs）要求和方法檢測靈敏度的要求。

2.4.3 方法的準確度、精密度

添加濃度為2.5μg/mL的20種農(nóng)藥混合標準儲備液至陰性大米樣品中，添加3個水平，濃度分別為0.01、0.05mg/kg和0.2mg/kg。每個水平重復6次，求平均值。

實驗表明：當添加濃度為0.01mg/kg時，20種農(nóng)藥在大米樣品中的回收率為86.7%～136.7%，相對標準偏差（RSD）≤16.4%。當添加濃度為0.05mg/kg時，20種農(nóng)藥在大米樣品中的回收率為67.7%～121.0%，相對標準偏差（RSD）≤14.9%。當添加濃度為0.2mg/kg時，20種農(nóng)藥在大米樣品中的回收率為76.0%～124.8%，相對標準偏差（RSD）≤7.4%。方法的回收率和相對標準偏差滿足多農(nóng)藥殘留檢測中的準確度和精密度的要求。

3 結(jié)論

采用QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法可以對大米中多種農(nóng)藥殘留同時進行檢測。20種農(nóng)藥的線性范圍為0.01μg/mL～0.2μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，大多數(shù)農(nóng)藥的加標回收率在70%～120%之間，相對標準偏差小于20%。因此該方法具有靈敏度高、操作簡單快捷，重現(xiàn)性好且回收率高的特點，適用于大米中多組分農(nóng)藥殘留的定量檢測與定性確證。

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Determination of 20 Kinds of Pesticide Residues in Rice by QuEChERS-Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Yu-yu1，SUN Hao1，*，DONG Zhen-lin2，GAO Shu-jie3，DU Mao4
（1.Food College-Dalian Polytechnic University，DaLian，116034，Liaoning，China；2.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116001，Liaoning，China；3.Jiangxi Research Institute of Food Fermentation，Yichun 336000，China；4.Luquan Agricultural Comprehensive Quality Inspection Station of Hebei Shijiazhuang，Shijiazhuang 050200，Hebei，China）

A simple，rapid and sensitive analytical method was developed to simultaneously determine multiple pesticide residues in rice.The residues in the samples were extracted by acetonitrile，cleaned up by developed QuEchERsmethod，and then analyzed by using GC-MS/MS in multiple reactions monitoring （MRM）mode. The pesticides were identified with retention time，selected ions and their relative abundances，and they were quantified based on extract of spiking standards in a blank sample.The results indicated that the linear range was between 0.01μg/mL and 0.2μg/mL of each pesticide，the linear correlation coefficients were greater than 0.99.The average recoveries of most pesticides were from 70%to120%and the RSDs of the20 pesticides were less than 20%.

gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）；rice；QuEChERS；pesticide residue

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.031

2013-12-18

孫玉玉（1990—），女（漢），碩士在讀，主要從事農(nóng)殘檢測方面的研究。

*通信作者：孫浩（1965—），男，副教授。