朱名毅，蒙山，高潔，趙爽，盧露碧

（右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000）

正交試驗(yàn)法優(yōu)選柚皮苷的提取工藝

朱名毅，蒙山，高潔，趙爽，盧露碧*

（右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000）

建立高效液相色譜檢測(cè)柚皮苷含量的方法，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比4個(gè)因素對(duì)柚皮苷提取率的影響，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用正交試驗(yàn)法優(yōu)化柚皮苷的提取工藝。結(jié)果表明：柚皮苷的最佳提取工藝為用50%的乙醇，按固液比1∶25進(jìn)行超聲提取60min，超聲提取功率50W。該優(yōu)選工藝合理、穩(wěn)定可行，在此優(yōu)化條件下提取柚皮苷的含量是6.134%。

柚皮；柚皮苷；正交試驗(yàn)；提取工藝

廣西沙田柚資源豐富，種植面積廣，產(chǎn)量大，而柚皮占沙田柚總重的30%左右。目前在沙田柚的食用或加工時(shí)，產(chǎn)生的柚皮往往被廢棄，不僅浪費(fèi)資源，而且會(huì)造成環(huán)境污染[1]。沙田柚皮中富含柚皮苷，而柚皮苷具有良好的抗氧化、降低血脂、促進(jìn)骨細(xì)胞生長(zhǎng)等功能[2-4]。柚皮苷易溶于乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑中，甲醇毒性較大，而乙醇毒性低、價(jià)格便宜，易于回收，綜合考慮以上因素及實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)需要，本試驗(yàn)擬對(duì)柚皮中柚皮苷的提取工藝進(jìn)行研究，并初步探討超聲波輔助提取柚皮苷的可行性，以期減少溶劑消耗，降低成本，從而為沙田柚皮中柚皮苷提取提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

柚皮苷對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110722-201111，純度＞98%，供含量測(cè)定用；乙醇，分析純：天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；甲醇，色譜純：美國(guó)TEDIA公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)。

新鮮沙田柚2012年11月購(gòu)于廣西百色市某超市，原產(chǎn)地為廣西容縣。

Ulti Mate3000型高效液相色譜儀：美國(guó)戴安公司；DL-180B型超聲波清洗器：上海之信公司，功率180W；BS124S萬(wàn)分之一電子天平：德國(guó)sartorius公司；DFX-1000A高速中藥粉碎機(jī)：廣州大祥公司。

1.2 方法

1.2.1 柚皮中柚皮苷的提取

將新鮮沙田柚洗凈，剝下果皮，分離黃色油胞層和白色海綿層，將白色海綿層切成大小為1 cm左右薄片，50℃烘干至水分含量為70 g/kg～80 g/kg，粉碎過(guò)40目（孔徑0.45mm）篩，制成柚皮干粉。精確稱取1.000 g柚皮干粉，置于100mL錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶液超聲，過(guò)濾，將濾液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中定容待測(cè)，取溶液進(jìn)行HPLC分析測(cè)定。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

以不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間和超聲提取功率，分別提取得到濾液，采用HPLC法在283nm處進(jìn)行柚皮中柚皮苷含量的測(cè)定，考察以上4個(gè)因素對(duì)柚皮苷提取含量的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)

由于在提取工藝優(yōu)化過(guò)程中，4個(gè)因素之間是相互影響的，為了全面考察4個(gè)因素的影響大小，故設(shè)計(jì)了一個(gè)四因素三水平的L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間和超聲提取功率對(duì)柚皮苷提取率的綜合影響，從中選擇最佳的提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚皮苷的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水溶液（體積比80∶20），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm。在此條件下，主要成分柚皮苷與其他成分有較好的分離效果，理論塔板數(shù)>3 000。見圖1、圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograghy of standard reference for naringin

圖2 提取物的色譜圖Fig.2 HPLC chromatograghy of pummelo peel

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取柚皮苷對(duì)照品2.0mg，置于20mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成200μg/mL的對(duì)照品貯備溶液，用0.22μm的有機(jī)系一次性針式過(guò)濾器過(guò)濾。

2.1.3 供試品溶液的制備

精確稱取1.000 g柚皮干粉，置于100m L錐形瓶中，加入一定量的乙醇水溶液超聲處理一段時(shí)間后，過(guò)濾，將濾液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中定容待測(cè)，每處理重復(fù)3次。

2.1.4 線性關(guān)系考察

精密量取柚皮苷對(duì)照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，分別置于20mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成不同濃度的對(duì)照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得到柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)液的回歸方程為Y=1.812 5X-9.934 6，r=0.999 1。結(jié)果表明，柚皮苷對(duì)照品濃度在0.10μg/m L～0.82μg/m L之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取柚皮苷對(duì)照品溶液20μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次檢測(cè)峰面積，結(jié)果其峰面積的RSD為3.56%，表示該方法的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品提取液各20μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，結(jié)果其峰面積的RSD為2.57%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)供試品6份，每份1.000 g，按“2.1.3”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“3.1.1”項(xiàng)下測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果沙田柚中柚皮苷平均含量1.39%，RSD為2.19%，表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

取同一份供試品1.000 g，精密稱定，分別加入相應(yīng)量的柚皮苷對(duì)照品，按“3.1.3”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為101.32%，RSD為1.31%。

2.2 提取條件單因素的考察

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷提取含量的影響

取柚皮粉末7份，精密稱取每份1.000 g，分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇25mL，以30W功率超聲提取60min，濾液用對(duì)應(yīng)濃度的乙醇定容至50mL，按2.1的方法測(cè)定濾液中的柚皮苷含量，結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction of naringin

由圖3的結(jié)果可見，50%乙醇具有較好的提取效果，因此我們確定乙醇濃度考察的水平值為40%、50%和60%。

2.2.2 固液比對(duì)柚皮苷提取含量的影響

取柚皮粉末6份，精密稱取每份1.000 g，按固液比分別是1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35的比列加入50%的乙醇，以40W功率超聲提取60min，過(guò)濾液按2.1的方法測(cè)定濾液中的柚皮苷含量，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，固液比是1∶25時(shí)具有較好的提取效果，因此我們確定固液比考察的水平值為1∶20、 1∶25和1∶30。

圖4 固液比對(duì)柚皮苷提取效果的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction of naringin

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)柚皮苷提取含量的影響

取柚皮粉末5份，精密稱取每份1.000 g，按固液比1∶20加入50%的乙醇20mL，以40W功率超聲提取10、20、30、40、50、60min，過(guò)濾液按2.1的方法測(cè)定濾液中的柚皮苷含量，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)柚皮苷提取效果的影響Fig.5 Effect of time on the extraction of naringin

由圖5可知，超聲提取50min能達(dá)到較好的提取效果，因此我們確定提取時(shí)間考察的水平值為40、50和60min。

2.2.4 提取功率對(duì)柚皮苷提取含量的影響

取柚皮粉末5份，精密稱取每份1.000 g，按固液比1∶20加入50%的乙醇20mL，超聲提取50min，超聲提取功率分別20、30、40、50、60W，過(guò)濾液按2.1的方法測(cè)定濾液中的柚皮苷含量，結(jié)果見圖6。

圖6 提取功率對(duì)柚皮苷提取效果的影響Fig.6 Effect of ultrasound on the extraction of naringin

由圖6可知，超聲提取功率為50W的時(shí)候具有較好的提取效果，因此我們確定超聲提取功率考察的水平值為40、50、60W。

2.3 沙田柚柚皮苷提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素考察試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平值。依照L9（34）正交表安排試驗(yàn)，并按“2.1”的方法，對(duì)各工藝所提得柚皮苷含量進(jìn)行考察，具體因素水平和試驗(yàn)結(jié)果及對(duì)結(jié)果的方差分析，見表1～表3。

表1 柚皮苷提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis

通過(guò)極差分析（表2）和方差分析（表3）可知，在正交試驗(yàn)條件下，4個(gè)因素對(duì)柚皮苷提取率的影響從大到小依次是：提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>固液比>提取功率，而由表3的方差分析結(jié)果可知提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比對(duì)提取率有顯著性差異，提取功率對(duì)提取率沒(méi)有顯著性影響。綜合得到柚皮苷提取工藝的優(yōu)化條件是A2B2C3D3，即用50%乙醇超聲提取，提取功率為50W，提取時(shí)間為60min，固液比是1∶25。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取柚皮粉末3份，精密稱量每份1.000 g，按照A2B2C3D3的條件制備樣品，測(cè)定柚皮苷的含量，結(jié)果得到3份樣品中柚皮苷的含量平均值為6.143%，RSD為1.87%。說(shuō)明該超聲提取工藝穩(wěn)定、合理。

3 結(jié)論

本文建立了簡(jiǎn)便、快捷的高效液相色譜法，用于測(cè)定柚皮中柚皮苷的含量，并對(duì)柚皮苷的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果表明：柚皮苷在0.10μg/mL～0.82μg/mL（r=0.999 1）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD分別是3.56%和2.19%，其加樣回收率101.32%，適合柚皮苷的測(cè)定。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果表明：超聲波輔助提取柚皮苷的最佳工藝條件為超聲提取功率50W，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，固液比1∶25（g/mL），提取時(shí)間60min，在該優(yōu)化工藝條件下提取柚皮苷的含量是6.143%。

[1]陽(yáng)梅芳,曾新安,楊星,等.沙田柚中不同部位黃酮類物質(zhì)的分布及含量探討[J].食品工業(yè)科技,2013,34(1):89-91,96

[2] 李赤翎,俞建,曾亮,等.柚皮苷對(duì)豬肉的抗氧化作用的研究[J].食品研究與開發(fā),2008,29(10):20-23

[3] 孫勝亮.柚皮活性成分提取分離及其在降血脂方面研究[D].西南大學(xué),2011

[4]唐琪,王維倩,王仁飛,等.柚皮苷對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖功能的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,34(2):171-172

Ptimization of Extraction Technology for Nariingin from Pummelo Peel by Orthogonal Experiment

ZHU Ming-yi，MENG Shan，GAO Jie，ZHAO Shuang，LU Lu-bi*
（Department of basic medical，Youjiang Medical University For Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

A high performance liquid chromatographic method was developed for determining the content of naringin.The effects of ultrasonic time，ultrasonic power，ethanol concentration and solid-liquid ratio factorson the narngin extraction rate were investigated by single-factor experiments.Based on the above work，the extraction technology of naringin was optimized by orthogonal experiment.The optimal extraction technology was as follow：the ethanol concentration was50%，the solid-liquid ratio was1∶25，the ultrasonic power was 50W and extracting time was 60min.The extraction content of naringin was 6.134%by the above method.

pummelo peel；naringin；orthogonal experiment；extrating technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.032

2013-12-03

朱名毅（1982—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：中藥資源研究開發(fā)與利用。

*通信作者