周鴻立，張英珍，郭志紅

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022；2.吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130000）

三氯乙酸-酶法脫玉米須多糖中蛋白質(zhì)工藝的優(yōu)化

周鴻立1，張英珍1，郭志紅2

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022；2.吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130000）

通過(guò)比較氯化鈣法、鹽酸法、三氯乙酸法、Sevag和酶法聯(lián)用法、三氯乙酸和酶法聯(lián)用法等5種方法對(duì)玉米須多糖進(jìn)行脫蛋白純化實(shí)驗(yàn)，以蛋白脫除率和多糖保留率及綜合評(píng)分為指標(biāo)，探尋玉米須多糖最佳脫蛋白質(zhì)方法。結(jié)果三氯乙酸和酶聯(lián)用法最佳條件為酶底比2.5（mg/L）、溫度50℃、水解時(shí)間1 h、TCA濃度為25%、樣液體積比為4∶1、靜置時(shí)間為40min，多糖的純度由13.2%提高到24.2%，蛋白脫除率為60.1%，多糖保留率為87.5%。此工藝條件簡(jiǎn)便有效，適用于玉米須多糖中蛋白質(zhì)的脫除。

玉米須；多糖；三氯乙酸-酶；脫蛋白

玉米須是禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱頭，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)玉米須多糖有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保肝、降血糖、利尿、解熱、利膽、延長(zhǎng)胃排空時(shí)間和降低體重等作用且毒性低[1]。有關(guān)玉米須多糖提取和活性的報(bào)道比較多，分離、純化相對(duì)較少，主要由于采用水提醇沉等方法所得的多糖中常存在一定量的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)具有和多糖相似的溶解性，不能用常規(guī)的液液萃取或液固萃取來(lái)分離。常用蛋白沉淀劑如三氯乙酸、鞣酸等除去，少量蛋白質(zhì)可選用Sevag法。實(shí)驗(yàn)以蛋白脫除率、多糖保留率為指標(biāo)比較三氯乙酸和酶法聯(lián)用進(jìn)行脫蛋白工藝優(yōu)化，篩選出適合工業(yè)化生產(chǎn)的簡(jiǎn)單、高效的脫蛋白質(zhì)方法，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用玉米須提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米須藥材2010采自吉林省吉林市郊區(qū)；木瓜蛋白酶：廣西南寧杰沃利生物有限公司，酶活力6 000 U/mg，sigma分裝；考馬斯亮藍(lán)G-250：中國(guó)惠氏生化試劑有限公司；牛血清白蛋白：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、三氯乙酸、苯酚、濃硫酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

循環(huán)水式多用真空泵（SHB-IIIA）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A）：上海亞榮生化儀器廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（725）：山東高密彩虹分析儀器有限公司；分析天平（FA-2004型）：上海精細(xì)科技儀器廠；臺(tái)式離心機(jī)（LDZ5-2型）：北京醫(yī)用離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的制備

玉米須干燥后粉碎，過(guò)40目篩。準(zhǔn)確稱取100 g，用石油醚脫脂后，放入5 000m L的圓底燒瓶中，加蒸餾水約至3 000mL，浸泡過(guò)夜，于90℃水浴提取1 h，提取液過(guò)濾。第2次加水2 000mL，提取30min，過(guò)濾；合并2次濾液濃縮至總體積的1/5，加無(wú)水乙醇至體積分?jǐn)?shù)70%以上，靜置24 h，3 500 r/min離心5min，回收乙醇，沉淀部分真空干燥得粗多糖。實(shí)驗(yàn)時(shí)配成0.2%粗多糖溶液，放入冰箱冷藏待用[2]。

1.3.2 多糖和蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

多糖含測(cè)采用苯酚-濃硫酸法，蛋白質(zhì)含測(cè)采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[2]。

多糖保留率/%=脫蛋白后多糖含量/脫蛋白前多糖含量×100

蛋白去除率/%=（脫蛋白前蛋白含量－脫蛋白后蛋白含量）/脫蛋白前蛋白含量×100

綜合評(píng)分=（每次脫蛋白率/每組最高脫蛋白率）× 0.5×100＋（每次多糖保留率/每組最高多糖保留率）× 0.5×100[3]

1.3.3 四種脫蛋白方法的比較

1）鹽酸法[4-5]：取多糖液于試管中，調(diào)pH為1，20℃放置6 h，4 000 r/min離心，測(cè)含量。

2）氯化鈣法[6]：取多糖液于試管中，調(diào)pH為9，加熱至85℃時(shí)，加入氯化鈣試劑，振搖2min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心，測(cè)含量。

3）三氯乙酸法[7]：取多糖液于試管中，加入三氯乙酸，振搖，超聲10min，4 000 r/min離心，測(cè)含量。

4）酶-Sevag法[3，8]：以酶底比2.5mg/L，取100mL多糖液，調(diào)pH為5，加入木瓜蛋白酶0.25mg，50℃恒溫1 h，然后沸水浴5min滅酶，冷卻至室溫后4 000 r/min離心。上清液用Sevag試劑（氯仿-正丁醇體積比為5∶1，樣液與試劑體積比為2∶1）脫蛋白2次，每次振蕩8min，靜置分層，分離后4 000 r/min離心，測(cè)含量。

1.3.4 三氯乙酸-酶聯(lián)用法單因素考察

固定上述木瓜蛋白酶水解玉米須多糖中蛋白的最佳條件[3]，改變?nèi)纫宜岬臐舛?，體積比，靜置時(shí)間等三因素，測(cè)定多糖和蛋白的吸光度值，并計(jì)算脫蛋白率和多糖保留率考察各因素對(duì)脫蛋白效果的影響[9]。

1.3.4.1 TCA濃度的選擇

取4支試管，準(zhǔn)確移取5m L多糖液，分別選取2.5mL不同濃度10%、15%、20%、25%的TCA溶液，搖勻后超聲5min，靜置30min，離心取上清液。

1.3.4.2 TCA體積的選擇

取4支試管，準(zhǔn)確移取4、5、5.5、6mL多糖液，再依次加入10%TCA溶液各3、2、1.5、1.0m L，搖勻后超聲5min，靜置30min，離心取上清液。

1.3.4.3 靜置時(shí)間的選擇

取4支試管，準(zhǔn)確移取5mL多糖液和10%TCA 2.5mL，搖勻后超聲5min，分別選取靜置時(shí)間為30、60、120、180min，離心取上清液。

1.3.5 三氯乙酸-酶聯(lián)用法正交探索實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取TCA濃度、體積比和靜置時(shí)間為考察因素，采用三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，以脫蛋白率和多糖保留率為指標(biāo)，篩選最佳脫蛋白條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table1 Design of the orthogonal experiment

2 結(jié)果

2.1 4種脫蛋白方法的結(jié)果

4種脫蛋白方法的結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 脫蛋白方法比較Fig.1 Compared with the methods of deproteinization

由圖1可知，酶法和Sevag聯(lián)用法脫蛋白率為69.7%，多糖保留率為88.5%，較其它3種方法脫蛋白效果更好，蛋白含量最低，多糖含量最高。多糖純度由13.2%提高為23.7%。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 TCA濃度的選擇

三氯乙酸法脫蛋白濃度影響因素如圖2。

圖2 TCA濃度因素Fig.2 The concentration factor of TCA

由圖2可知隨著三氯乙酸濃度的增大，脫蛋白率和多糖保留率都增大，但當(dāng)三氯乙酸達(dá)到0.2時(shí)，脫蛋白效果最佳，脫蛋白率為53.2%，多糖保留率89.4%。

2.2.2 TCA體積的選擇

三氯乙酸法脫蛋白樣品與溶液體積比影響因素如圖3。

圖3 TCA樣液比因素Fig.3 The volume ratio factor of TCA

由圖3可知，TCA體積因素的脫蛋白率和多糖保留率，當(dāng)體積比為3∶1時(shí)，脫蛋白效果最佳，脫蛋白率為43.9%，多糖保留率64.9%

2.2.3 靜置時(shí)間的選擇

三氯乙酸法脫蛋白靜置時(shí)間影響因素如圖4。

圖4 靜置時(shí)間因素Fig.4 The factor of standing time

由圖4知，隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，脫蛋白率增加不明顯，且多糖保留率有明顯降低趨勢(shì)。故確定最佳靜置時(shí)間為30min，此時(shí)脫蛋白率為48.6%，多糖保留率為89.4%。

2.3 正交試驗(yàn)

通過(guò)三因素三水平正交表設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案，以脫蛋白率和多糖保留率，計(jì)算綜合評(píng)分，見(jiàn)表2。

表2 TCA+酶法正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理結(jié)果Table2 Results of the orthogonal experiment

由表2可得，正交試驗(yàn)的三因素中，影響關(guān)系大小依次為C＞B＞A，最優(yōu)條件為A2B3C3，即TCA濃度為25%，體積比為4∶1，靜置時(shí)間為40min。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取正交試驗(yàn)最佳因素組合A2B3C3做3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即酶底比2.5（mg/L），溫度50℃，水解時(shí)間1 h，TCA濃度為25%，體積比為4∶1，靜置時(shí)間為40min。結(jié)果3次脫蛋白率分別為60.3%、59.6%、60.4%，平均值60.1%，RSD 0.72%＜1.0%；多糖保留率為87.9%、87.1%、87.5%，平均值87.5%，RSD 0.46%＜1.0%，綜合評(píng)分97.8；多糖純度由13.2%提高為24.2%。驗(yàn)證所確定的工藝條件為最優(yōu)條件，并穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

采用5種脫蛋白方法，其中氯化鈣法操作簡(jiǎn)單、試劑廉價(jià)，但脫蛋白效果較其他方法差；鹽酸法脫蛋白效果相對(duì)較好，簡(jiǎn)單易操作，但由于強(qiáng)酸性會(huì)使一部分多糖降解，并降低多糖的活性。三氯乙酸法使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽，使之聚集沉淀除去，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定，其有蛋白脫除效果較好，但反應(yīng)較為強(qiáng)烈，易引起植物多糖的降解，多糖保留率相對(duì)聯(lián)合酶法偏低的缺點(diǎn)[8]。且有一定的化學(xué)試劑的殘留，脫除這些殘留試劑增加了后序的工作量。Sevag+酶法聯(lián)用，最佳工藝為氯仿-正丁醇體積比為5∶1，樣液與試劑體積比為2∶1，振蕩時(shí)間8min，脫蛋白次數(shù)2次，脫蛋白率69.7%，剩余率88.5%，多糖純度為23.7%。原料經(jīng)酶處理后，大部分游離蛋白被水解，經(jīng)過(guò)2次Sevag法脫蛋白處理，蛋白脫除率和多糖保留率相對(duì)而言都很高，可達(dá)到理想的去除蛋白的效果[10]，該方法的不足之處是脫蛋白過(guò)程中會(huì)除去浸提料液中糖蛋白等活性成分，并有易制毒化學(xué)試劑氯仿的殘留，因此所得多糖的應(yīng)用會(huì)受到限制。TCA+酶法優(yōu)化玉米須多糖脫蛋白的工藝，最佳條件為T(mén)CA濃度為25%，體積比為4∶1，靜置時(shí)間為40min，脫蛋白次數(shù)1次，蛋白脫除率為60.1%，多糖保留率為87.5%，多糖純度由13.2%提高為24.2%。

綜合結(jié)果認(rèn)為，TCA+酶法脫蛋白效果相對(duì)經(jīng)濟(jì)實(shí)用。兩種與酶聯(lián)用的方法得到純化多糖中仍含有少量蛋白質(zhì)，要得到純多糖制品，還需經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化，是否為糖蛋白復(fù)合物也需驗(yàn)證?？傊?，由于多糖的復(fù)雜性，其提取純化工藝的研究，不能單純考察純度，還應(yīng)注意損失率，以及結(jié)構(gòu)與活性之間的相關(guān)性。

[1]周鴻立,張艷,金海甲,等.玉米須多糖藥理作用及提取純化研究進(jìn)展[J].吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào),2009,26(1):23-26

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Optimum Deproteinization of Polysaccharide from Corn Silk by Trichloroacetic Acid-Enzyme

ZHOU Hong-li1，ZHANG Ying-zhen1，GUO Zhi-hong2
（1.Jilin Institute of Chemical Technology，College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin 132022，Jilin，China；2.College of Chemistry，Jilin University，Changchun 130000，Jilin，China）

To explore the optimum deproteinization conditions of crude polysaccharide from corn silk by compared with the five methods of calcium chloride，hydrochloric acid，trichloroacetic acid，sevag-enzyme and trichloroacetic acid-enzyme.The deproteinization rate，the remaining rate of polysaccharide and the comprehensive score were regarded as indexes.The optimum conditions of deproteinization by combined TCA and enzyme were the ratio between the enzyme and the solution 0.25%（g/L），temperature of 50℃，reaction time of1 h，TCA concentration of 25%，volume ratio of4∶1，standing time of 40min.Eventually the purity of crude polysaccharide was increased from 13.2%to 24.2%，the deproteinization rate was 60.1%，and the remaining rate was 87.5%.This method can be used as process method of deproteinization from corn silk，because the optimum technology is simple and efficient.

corn silk；polysaccharide；TCA-enzyme；deproteinization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.016

2013-10-28

吉林省科技廳科研項(xiàng)目（20130303050NY）；吉林省教育廳科研項(xiàng)目（2013319）；吉林化工學(xué)院科研項(xiàng)目（2014059）

周鴻立（1967—），女（漢），教授，博士，從事天然產(chǎn)物的研究與開(kāi)發(fā)。