孫萍，杜德紅，曹潤(rùn)智

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

鱈魚皮中硫酸皮膚素的提取工藝

孫萍，杜德紅，曹潤(rùn)智

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

以鱈魚皮為原料，采用木瓜蛋白酶和胰酶混合酶的方法，從鱈魚皮中提取硫酸皮膚素，并通過(guò)乙醇沉淀的方法得到最終產(chǎn)品。研究料液比、酶添加量、pH、時(shí)間和溫度等單因素對(duì)提取率的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)法對(duì)混合酶法提取硫酸皮膚素工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，混合酶提取硫酸皮膚素的最佳工藝為：料液比1∶25mg/mL、酶添加量0.5%、pH 8.5、提取時(shí)間22 h、提取溫度50℃。采用此工藝條件提取率達(dá)到4.409%。

鱈魚皮；木瓜蛋白酶；胰酶；硫酸皮膚素；提取

硫酸皮膚素（Dermatan sulfate，DS），又稱硫酸膚質(zhì)，硫酸軟骨素B。最早于1941年由豬皮中分離得到，呈白色或微黃色粉末，無(wú)臭，無(wú)味，吸水性強(qiáng)，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑中，其鹽類對(duì)熱較穩(wěn)定，受熱80℃亦不分解。硫酸皮膚素約含有50個(gè)～70個(gè)雙糖基本單位，經(jīng)HPLC測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量為15 000～45 000，平均相對(duì)分子質(zhì)量為35 700[1]。硫酸皮膚素主要用在醫(yī)學(xué)上，其主要功能有：抗血栓作用[3-4]，抗炎癥反應(yīng)，抗腫瘤作用[5-6]，促進(jìn)細(xì)胞再生作用[7]及藥劑開(kāi)發(fā)[8]。另外應(yīng)用在化妝品中阻止脂蛋白在血管壁上的沉積，促進(jìn)皮膚的更新，阻止皮膚的過(guò)度角質(zhì)化和棘皮癥，滋潤(rùn)皮膚、保持水分[9]。目前商品化硫酸皮膚素制劑的主要來(lái)源為豬皮，近年來(lái)也有從豬腸黏膜、牛肺、鰻鱺、魚、海鞘、雞冠、羊鼻軟骨中提取DS的研究[10-13]，鮮見(jiàn)從鱈魚中提取DS的相關(guān)報(bào)道。

以鱈魚加工中產(chǎn)生的大量下腳料鱈魚皮為對(duì)象，采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行水解，對(duì)鱈魚皮中的硫酸皮膚素的提取工藝進(jìn)行了初步研究，為硫酸皮膚素的大量生產(chǎn)提供理論參考。

1 試劑與儀器

1.1 材料

鱈魚皮：青島佳元水產(chǎn)公司，鱈魚種類為青島地區(qū)產(chǎn)狹鱈魚，同一批次新鮮鱈魚加工，無(wú)病害、無(wú)雜質(zhì)污染。

1.2 主要試劑

Q3357木瓜蛋白酶（200 u/mg～300 u/mg）：上海佳和生物科技公司；0458胰酶（250 u/mg），美國(guó)Amresco公司；DS標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；阿利新藍(lán)8GX：美國(guó)Waters公司；酪蛋白：上海基米生物科技公司。

1.3 主要儀器

UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；高速小容量離心機(jī)：上海安亭儀器廠；移液槍：上海恒奇儀器儀表有限公司；電熱恒溫水浴鍋：龍口市電爐制造廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酶法提取工藝流程

鱈魚皮→預(yù)處理→魚皮干品→加酶提取→浸提液→滅酶過(guò)濾得濾液→活性炭吸附澄清→乙醇沉淀得澄清液→虹吸、常溫干燥→成品

2.2 操作要點(diǎn)

2.2.1 鱈魚皮前處理

除去鱈魚皮上粘連的肌肉、雜質(zhì)等非魚皮成分，用清水洗凈魚皮，加適量丙酮洗滌除去脂肪，再用清水洗去殘留的丙酮?？馗婶~皮上的水分，將其展開(kāi)拉平，烘箱中36℃烘2 h，取出后在室溫條件下自然晾干。干燥狀態(tài)的魚皮質(zhì)量很輕，韌性很強(qiáng)，不易粉碎成粉末，改用剪刀將干燥好的魚皮剪成約2mm×2mm正方形小丁，裝入容器中并放置在陰涼干燥處備用。

2.2.2 酶解

準(zhǔn)確稱取木瓜蛋白酶和胰酶進(jìn)行酶解，以水解液中DS的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用分光光度計(jì)測(cè)定水解液的吸光值，選擇最佳的酶解工藝條件。

2.2.3 乙醇沉淀

將酶解液在90℃下滅酶10min并過(guò)濾，在濾液中加入其質(zhì)量3%的活性炭脫色15min，再次過(guò)濾，在澄清液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，隔夜沉淀，虹吸除去乙醇，將沉淀常溫干燥，即得硫酸皮膚素粗品。

2.2.4 硫酸皮膚素提取率的測(cè)定

采用阿利新藍(lán)法[14]。

2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在試管中分別加入0、40、60、80、100、120μL的DS標(biāo)準(zhǔn)液，用蒸餾水補(bǔ)足到200μL，準(zhǔn)確加入3.00mL 1.4mg/mL阿利新藍(lán)8GX染液，混勻，10min后，在480 nm比色測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4.2 樣品測(cè)定

酶解液在90℃下滅酶10 min并過(guò)濾，移取10.00mL濾液并稀釋定容，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，將濾液定容至50mL時(shí)吸光度值在0.1～0.7間符合朗伯比爾定律。移取1.00m L蒸餾水，1.00m L樣液于10m L試管中，加入3.00mL 1.4mg/mL阿利新藍(lán)8GX染液，混勻，反應(yīng)10min后，在480 nm處比色測(cè)定吸光值A(chǔ)。

2.2.4.3 硫酸皮膚素提取率計(jì)算

式中：Y為硫酸皮膚素提取率，%；C為硫酸皮膚素濃度，（mg/mL）；50為每10 mL樣液定容稀釋到50 mL；10為10mL樣液；V為每份樣品酶解時(shí)加入的蒸餾水的體積，mL；W為每份樣品的質(zhì)量（本實(shí)驗(yàn)為5 g）。

2.2.5 硫酸皮膚素提取的單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶和胰酶混合提取兩種酶添加量比例為1∶1，分別進(jìn)行提取的單因素實(shí)驗(yàn)，考察料液比，酶添加量，pH，提取時(shí)間，提取溫度等對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響。

2.2.6 硫酸皮膚素提取的正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上以料液比、混合酶添加量、pH、提取時(shí)間和提取溫度5個(gè)因素，每因素四水平，以硫酸皮膚素提取率為考察指標(biāo)，使用L16（45）正交表安排實(shí)驗(yàn)，如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental range and levels of the independent variables

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 硫酸皮膚素濃度與吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Concentration of dermatan sulfate and absorption standard curve

圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.471 6x+0.008 7，y為吸光度值，x為硫酸皮膚素標(biāo)準(zhǔn)液濃度，R2=0.993 7。3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 料液比對(duì)提取率的影響

料液比對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on yield of dermatan sulfate

料液比對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響呈先升后降的趨勢(shì)，在料液比為1∶20（mg/mL）～1∶30（mg/mL）時(shí)提取率較高，繼續(xù)增大料液比，稀釋了酶的濃度，影響其作用的發(fā)揮，導(dǎo)致提取率的降低。所以本實(shí)驗(yàn)選擇料液比為1∶20（mg/mL）。

3.2.2 混合酶添加量對(duì)提取率的影響

混合酶添加量對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響如圖3所示。

圖3 混合酶添加量對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響Fig.3 Effect of mixed enzymes addition on yield of dermatan sulfate

酶的添加量從0.5%增加到1%，硫酸皮膚素的提取率逐漸提高，但隨著酶量的增加提取率不升反降，其原因可能是1%左右的加酶量就足以使樣品全部水解，酶作為一種蛋白質(zhì)，未起作用的多余的酶的性質(zhì)發(fā)生了改變，可能水解成多肽或小的片段，在提取液中影響提取率的測(cè)定。同時(shí)考慮到成本因素，1%為最適合的酶添加量。

3.2.3 pH對(duì)提取率的影響

pH對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響如圖4所示。

圖4 pH對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響Fig.4 Effect of pH on yield of dermatan sulfate

提取率在pH8.0之前呈上升趨勢(shì)，在pH3.0～4.0，5.0～6.0范圍內(nèi)坡度較緩，而且提取率基本相等。pH6.0以后，提取率急速上升，約在pH8.0處達(dá)最大值，而pH8.0以后提取率又急速下降，說(shuō)明在這個(gè)范圍的pH對(duì)提取率的影響極大，所以選擇pH8.0為最適合pH。

3.2.4 溫度對(duì)提取率的影響

溫度對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響如圖5所示。

圖5 溫度對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on yield of dermatan sulfate

溫度的變化對(duì)提取率的影響較為緩和，60℃以前平緩增加，60℃時(shí)達(dá)最大值，隨著溫度升高，提取率又有所降低。即便較高的溫度有助于提高提取率，但高溫條件下會(huì)破壞硫酸皮膚素的結(jié)構(gòu)，影響生物活性，本實(shí)驗(yàn)采用60℃為最佳提取溫度。

3.2.5 時(shí)間對(duì)提取率的影響

時(shí)間對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響如圖6所示。

在所有因素中，時(shí)間的變化對(duì)提取率的影響最不明顯，尤其在16 h～28 h之間，小于16 h有一個(gè)較為顯著的上升趨勢(shì)，考慮到實(shí)際生產(chǎn)周期以及短時(shí)間提取可能引起產(chǎn)品純度不高等因素，綜合比較，選擇20 h為宜。

圖6 時(shí)間對(duì)硫酸皮膚素提取率的影響Fig.6 Effect of time on yield of dermatan sulfate

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal design and results

影響硫酸皮膚素提取率的因素主次順序?yàn)椋篊＞A＞B＞E＞D，即pH＞料液比＞酶添加量＞提取溫度＞提取時(shí)間。硫酸皮膚素最佳提取工藝條件為：A3B1C4D3E1，即料液比為1∶25，酶添加量0.5%，pH8.5，提取時(shí)間22 h，提取溫度為50℃。按上述最佳條件，從鱈魚皮中提取硫酸皮膚素，經(jīng)3次提取，平均提取率為4.409%。

本文采用正交試驗(yàn)探討硫酸皮膚素提取的最佳工藝條件，最后提取物為硫酸皮膚素粗品，可能含有其它種類的糖胺聚糖和小分子的蛋白質(zhì)。以后的工作將對(duì)粗品進(jìn)行分離提純，對(duì)硫酸皮膚素含量進(jìn)行測(cè)定。

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Extraction of Dermatan Sulfate from Cod Skin

SUN Ping，DU De-hong，CAO Run-zhi
（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

In this paper，the dermatan sulfate was extracted from cod skin with mixed enzymes including papain and trypsin to obtain the final product through ethanol precipitation.The optimum extracting conditions of dermatan sulfate were investigated by single factor and orthogonal tests.The results showed that the optimum technological conditions were as follows：liquid-solid ratio was 25∶1，enzymes addition was 0.5%，pH8.5，extraction time was 22 h，extraction temperature was 50℃.Extraction rate was 4.409%by this process conditions.

cod skin；papain；trypsin；dermatan sulfate；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.007

2013-12-02

孫萍（1969—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。