郭欣欣， 于新惠， 張 穎， 羅 勤

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

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單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)致病性的研究

郭欣欣， 于新惠， 張 穎， 羅 勤*

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是李斯特菌病的病原細(xì)菌。用Lm野生株EGDe、弱毒株ΔprfA、毒力回復(fù)株+prfA和高毒株+prfA*喂飼模式生物秀麗隱桿線蟲(chóng)N2，并以線蟲(chóng)的良好食源大腸埃希菌OP50以及非致病的無(wú)害李斯特菌(Listeriainnocua)作為對(duì)照，檢測(cè)Lm對(duì)線蟲(chóng)發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)以無(wú)害李斯特菌、Lm野生株以及PrfA突變株為食時(shí)，線蟲(chóng)的產(chǎn)卵數(shù)雖有所下降，但線蟲(chóng)不僅能夠正常產(chǎn)卵，而且其發(fā)育周期和壽命均較以O(shè)P50為食時(shí)顯著延長(zhǎng)(P≤0.05)；線蟲(chóng)體表和消化道中均可檢測(cè)到大量李斯特菌，但糞便中的活菌數(shù)極少。以上結(jié)果說(shuō)明Lm不能殺死秀麗隱桿線蟲(chóng)，對(duì)線蟲(chóng)也沒(méi)有顯著致病性，不適合作為研究Lm致病機(jī)制的模型；Lm可在線蟲(chóng)體表和消化道存在，暗示Lm可借助線蟲(chóng)在土壤環(huán)境中生存和傳播。

單核細(xì)胞增生李斯特菌；秀麗隱桿線蟲(chóng)；PrfA；致病性；模型

秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)是一種以細(xì)菌為食、自由生活的小型土壤線蟲(chóng)。因其具有全身透明易于觀察、生命周期短、操作方便簡(jiǎn)單、培養(yǎng)成本低廉、可操控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為應(yīng)用越來(lái)越廣泛的模式生物。用病原細(xì)菌喂飼線蟲(chóng)，如果病原菌可以對(duì)線蟲(chóng)致病，則線蟲(chóng)可能作為研究病原菌致病機(jī)制的模型。目前該方面的研究已成功用于發(fā)現(xiàn)或確定金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei)等細(xì)菌的毒力因子[1]，鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)與宿主相互作用關(guān)系，以及耐藥機(jī)制等多個(gè)方面。單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，以下簡(jiǎn)稱Lm)是一種無(wú)芽胞兼性厭氧革蘭陽(yáng)性菌，在自然界中廣泛分布, 土壤、污水、人和動(dòng)物的糞便、飼料以及多種食品中均有該菌存在 。通過(guò)攝入被其污染的食物, 人和動(dòng)物能罹患李斯特菌病(Listeriosis)，引起腦膜炎、骨髓炎、心肌炎、孕婦流產(chǎn)以及產(chǎn)褥感染等疾病，死亡率高達(dá)30%～70%，因此被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為關(guān)系食品衛(wèi)生安全的重要的食源性致病菌之一。PrfA (Positive regulatory factor A) 是Lm中調(diào)控絕大多數(shù)毒力基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的重要毒力因子，在細(xì)菌侵染宿主并導(dǎo)致疾病中起著至關(guān)重要的作用，缺失其編碼基因prfA將極大降低該菌的致病能力[2]。和其他病原細(xì)菌一樣，Lm對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的致病能力也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，然而迄今為止該方面的研究結(jié)果卻爭(zhēng)議巨大。一方面，Thomsen等[3]報(bào)道Lm能夠在線蟲(chóng)腸道內(nèi)積累并殺死線蟲(chóng)，而缺失了毒力因子PrfA 和DegU的突變株卻不能殺死線蟲(chóng)，因此認(rèn)為秀麗隱桿線蟲(chóng)可以作為研究Lm毒力因子的模型；另一方面，Guha等[4]卻發(fā)現(xiàn)浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)的Lm均不能感染和殺死線蟲(chóng)，線蟲(chóng)不能成為研究Lm致病機(jī)制的模型。為了確證Lm對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的致病作用，利用本實(shí)驗(yàn)保存和構(gòu)建的無(wú)害李斯特菌(Listeriainnocua)標(biāo)準(zhǔn)株CLIP 11262和Lm標(biāo)準(zhǔn)野生株EGDe以及該菌衍生的3種PrfA突變株喂飼秀麗隱桿線蟲(chóng)野生型N2，即：△prfA(缺失PrfA的編碼基因prfA，菌株毒力極大減弱[2])、+prfA(高拷貝回復(fù)野生型prfA基因到△prfA中, 菌株毒力恢復(fù))、+prfA*(回復(fù)prfA的突變基因prfA*到△prfA中，使其PrfA蛋白組成性高表達(dá)，菌株毒力極大增強(qiáng))，比較觀察線蟲(chóng)發(fā)育周期、壽命、產(chǎn)卵數(shù)以及線蟲(chóng)體表、消化道和糞便中細(xì)菌數(shù)的差異，從而探討線蟲(chóng)是否適合作為研究Lm致病機(jī)制的模型。

1 材料與方法

1.1 線蟲(chóng)、細(xì)菌及培養(yǎng)條件

秀麗隱桿線蟲(chóng)野生型N2和大腸埃希菌 OP50由華中師范生命科學(xué)學(xué)院王國(guó)秀教授惠贈(zèng)，OP50在NGM (Nematode growth medium)[5]液體培養(yǎng)中培養(yǎng)到OD600為0.6，取100 μL均勻涂布到NGM瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)至平板長(zhǎng)滿細(xì)菌后，轉(zhuǎn)接線蟲(chóng)到平板上，25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。無(wú)害李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株CLIP 11262以及單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株EGDe由德國(guó)維爾茨堡大學(xué)Werner Goebel教授惠贈(zèng)，EGDe衍生的3種PrfA突變株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[6]，EGDe和△prfA 采用BHI (Brain Heart Infusion, B&D公司) 培養(yǎng)基培養(yǎng)；+prfA 和+prfA*在含有20 μL/mL紅霉素的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以上細(xì)菌在BHI液體培養(yǎng)中培養(yǎng)到OD600至0.6，取100 μL均勻涂布到BHI瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)至平板長(zhǎng)滿細(xì)菌后，轉(zhuǎn)接線蟲(chóng)到平板上，25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 線蟲(chóng)的同步化

參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行：首先在生長(zhǎng)有OP50的線蟲(chóng)NGM平板上大量培養(yǎng)線蟲(chóng)，用M9緩沖液將線蟲(chóng)沖于離心管中，清洗，加入裂解液。將裂解得到的蟲(chóng)卵置于無(wú)OP50的NGM培養(yǎng)基中孵化。將孵化得到的L1期線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到有OP50的NGM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得生長(zhǎng)狀態(tài)一致的同步化的線蟲(chóng)。

1.3 培養(yǎng)基和抗生素對(duì)線蟲(chóng)生存曲線和壽命的影響

分別將10條同步化的L4期線蟲(chóng)接入無(wú)菌、無(wú)抗生素的BHI平板或者添加20 μL/mL紅霉素(Amresco公司)的BHI平板，以及無(wú)菌NGM平板上，25 ℃培養(yǎng)，若線蟲(chóng)對(duì)于觸碰無(wú)反應(yīng)則判斷線蟲(chóng)死亡。每隔12 h觀察線蟲(chóng)生活狀況，記錄存活線蟲(chóng)的數(shù)目，計(jì)算線蟲(chóng)存活率。以線蟲(chóng)的存活率為縱坐標(biāo)，觀察時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，即為線蟲(chóng)的生存曲線。線蟲(chóng)壽命的測(cè)定方法見(jiàn)1.5, 喂飼菌苔為OP50，分別培養(yǎng)在BHI和NGM平板上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 線蟲(chóng)發(fā)育周期的測(cè)定

方法參考Lin等[7]的報(bào)道，分別挑取10條同步化的L1期線蟲(chóng)于生長(zhǎng)有待檢細(xì)菌菌苔的平皿上，待卵產(chǎn)生后，收集大約20 顆卵分別置于新鮮培養(yǎng)基上，此時(shí)記為0 h。25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，每隔3 h觀察1次，直到新卵產(chǎn)生，記錄每條線蟲(chóng)從卵孵化到成蟲(chóng)再到產(chǎn)卵所需時(shí)間，即為線蟲(chóng)的發(fā)育周期。不同細(xì)菌每次挑選10 只線蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè), 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 線蟲(chóng)壽命的測(cè)定

參照Lin等[7]的方法，將同步化的L1期線蟲(chóng)單個(gè)移入生長(zhǎng)有待檢細(xì)菌的平板中，25 ℃培養(yǎng)，直至死亡。記錄線蟲(chóng)從開(kāi)始培養(yǎng)直到死亡所經(jīng)歷的時(shí)間，即線蟲(chóng)的壽命。為保證有新鮮的食物，每3 d 將線蟲(chóng)重新轉(zhuǎn)板, 所有在培養(yǎng)期間鉆入瓊脂和爬壁上死亡的線蟲(chóng)都不計(jì)入結(jié)果。不同細(xì)菌每次挑選10只線蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè), 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 線蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)的測(cè)定

參照Brenner等[5]的方法進(jìn)行：將同步化的L4期線蟲(chóng)單個(gè)移入生長(zhǎng)有待檢細(xì)菌的平板中，25 ℃培養(yǎng)，為保證有新鮮的食物，每24 h 將線蟲(chóng)重新轉(zhuǎn)板。記錄每條線蟲(chóng)的總產(chǎn)卵量。不同細(xì)菌每次挑選3只線蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)定, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 線蟲(chóng)體表細(xì)菌計(jì)數(shù)方法

參照Guha等[4]的方法進(jìn)行：將同步化的線蟲(chóng)分別在待檢細(xì)菌平板上培養(yǎng)至L4期，挑取10 條線蟲(chóng)移入1.5 mL的離心管中，加入0.5 mL的M9緩沖液渦旋震蕩10 min后, 再靜置5 min使線蟲(chóng)沉淀到管的底部，小心吸取100 μL上清液進(jìn)行梯度稀釋。分別取100 μL梯度稀釋液涂布BHI平板，每個(gè)稀釋濃度涂布3個(gè)平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，記錄平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌個(gè)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 線蟲(chóng)消化道細(xì)菌計(jì)數(shù)方法

參照Guha等[4]的方法進(jìn)行：分別挑取20 只在待檢細(xì)菌平板上培養(yǎng)傳了3代的L4期線蟲(chóng)，置于含有60 μg/mL慶大霉素的LB平板上，25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h殺死線蟲(chóng)體表的細(xì)菌后，將線蟲(chóng)移入1.5 mL離心管，用M9緩沖液渦旋振蕩洗滌線蟲(chóng)。將洗滌過(guò)的線蟲(chóng)置于新的離心管中，加入0.5 mL M9緩沖液和100 mg石英砂，劇烈渦旋振蕩5 min裂解線蟲(chóng)，裂解后進(jìn)行梯度稀釋，吸取100 μL梯度稀釋液涂布BHI平板，每個(gè)稀釋濃度涂布3個(gè)平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，記錄平板上細(xì)菌克隆個(gè)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 線蟲(chóng)糞便細(xì)菌計(jì)數(shù)

參照Guha等[4]的方法進(jìn)行：分別挑取10 只在待檢細(xì)菌平板上培養(yǎng)傳了3代的L4期線蟲(chóng)，用含有60 μg/mL慶大霉素的M9緩沖液充分洗滌線蟲(chóng)，以除去線蟲(chóng)體表殘余的細(xì)菌。然后將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌BHI平板上繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，移走線蟲(chóng)，將平板置于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，記錄平板上產(chǎn)生的細(xì)菌個(gè)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 線蟲(chóng)對(duì)食物的趨向性

取50 μL大腸埃希菌OP50、EGDe、△prfA、+prfA和+prfA*(OD600=0.6左右)分別均勻滴加到BHI固體培養(yǎng)基上5個(gè)與中心點(diǎn)等距離的區(qū)域，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)移100 條同步化的L2期線蟲(chóng)于培養(yǎng)基中心，25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，記錄移動(dòng)到各種菌上的線蟲(chóng)數(shù)量，連續(xù)觀察12 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 7.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性檢驗(yàn)采用Student’s t-tests 方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基和抗生素對(duì)線蟲(chóng)生存曲線和壽命的影響

盡管Lm在自然界分布廣泛，能夠在包括高鹽、低溫和低pH等逆境中生存, 但Lm在常用細(xì)菌培養(yǎng)基Luria-Bertani(LB)上生長(zhǎng)緩慢，也不能在常用的線蟲(chóng)培養(yǎng)基NGM上生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)驗(yàn)室通常使用營(yíng)養(yǎng)豐富的腦心浸液BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)李斯特菌。同時(shí)，因?yàn)長(zhǎng)mEGDe毒力調(diào)控蛋白PrfA缺失回復(fù)株+prfA 和PrfA組成性高表達(dá)突變株+prfA*中具有表達(dá)PrfA蛋白的質(zhì)粒，培養(yǎng)這兩株細(xì)菌需要添加20 μL/mL紅霉素，然而，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)明確闡述BHI培養(yǎng)基以及紅霉素對(duì)線蟲(chóng)的影響，因此，在研究檢測(cè)Lm對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的致病能力之前，有必要事先排除培養(yǎng)李斯特菌的BHI培養(yǎng)基以及紅霉素對(duì)線蟲(chóng)生存能力的影響。如圖1所示：L4期線蟲(chóng)在無(wú)菌的BHI平板上的生存時(shí)間與在無(wú)菌的NGM平板上相同，均為13 d；添加20 μL/mL的紅霉素不影響線蟲(chóng)在BHI平板上的生存；而且從生存曲線來(lái)看， BHI平板還略微提高了線蟲(chóng)在生命中后期(第6到12天)的生存率。同時(shí)，當(dāng)以大腸埃希菌OP50為食源時(shí)，線蟲(chóng)在BHI和NGM平板上的壽命分別是15.2和15.5 d(參見(jiàn)2.2.1結(jié)果)，也沒(méi)有顯著變化。以上實(shí)驗(yàn)表明：BHI培養(yǎng)基和濃度為20 μL/mL的紅霉素不影響線蟲(chóng)的生存和壽命，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以忽略BHI培養(yǎng)基以及紅霉素對(duì)線蟲(chóng)的作用。

圖1 培養(yǎng)基和抗生素對(duì)線蟲(chóng)生存時(shí)間的影響Fig.1 The survival curves of C. elegans on NGM and BHI plates with (BHI with Em) or without 20 μL/mL of erythromycin

2.2 單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)線蟲(chóng)的致病能力

無(wú)害李斯特菌(L.innocua)的基因組與單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組具有高度的保守性和共線性，但因其不具有PrfA以及相關(guān)毒力因子，對(duì)人畜無(wú)致病能力[8]。本實(shí)驗(yàn)在使用大腸埃希菌OP50作為參照的同時(shí)，也選擇了無(wú)害李斯特菌作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，比較研究了Lm野生株EGDe及其3種PrfA突變株(即弱毒力株△prfA、毒力回復(fù)株+prfA和高毒株+prfA*)對(duì)線蟲(chóng)發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響，從而確定Lm對(duì)線蟲(chóng)是否有致病作用。

2.2.1 單核細(xì)胞增生李斯特菌和無(wú)害李斯特菌對(duì)線蟲(chóng)發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響 如表1，當(dāng)以無(wú)害李斯特菌、Lm野生株以及PrfA突變株為食時(shí)，線蟲(chóng)不僅能夠正常產(chǎn)卵，而且其發(fā)育周期和壽命均較以O(shè)P50為食時(shí)顯著延長(zhǎng)(P≤0.05)，特別是高毒株+prfA*有極顯著的延長(zhǎng)作用(P≤0.01)；線蟲(chóng)的產(chǎn)卵數(shù)雖有不同程度降低，但以各種李斯特菌為食時(shí)，均能正常產(chǎn)卵，而且，Lm野生株和無(wú)害李斯特菌對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)的影響并不顯著(P>0.05)，但弱毒株△prfA和高毒株+prfA*卻顯著降低了產(chǎn)卵數(shù)(P≤0.05)；更為重要的是，本實(shí)驗(yàn)所使用的Lm野生株和PrfA突變株(弱毒力株△prfA、毒力回復(fù)株+prfA和高毒株+prfA*)均是文獻(xiàn)報(bào)道并被確認(rèn)的具有顯著毒性差異的Lm菌株，但這些菌株對(duì)線蟲(chóng)發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的作用趨勢(shì)完全一致，表明李斯特菌毒力基因的不同表達(dá)對(duì)線蟲(chóng)沒(méi)有顯著差異作用，線蟲(chóng)不是研究單核細(xì)胞增生李斯特菌致病機(jī)制的良好模型。

表1 單核細(xì)胞增生李斯特菌和無(wú)害李斯特菌對(duì)線蟲(chóng)發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響

注：a、b表示與用大腸埃希菌OP50喂飼的線蟲(chóng)相比，無(wú)害李斯特菌和4種單核細(xì)胞增生李斯特菌喂飼的線蟲(chóng)在發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)方面的差異顯著性，其中a≤ 0.05，b≤ 0.01；c、 d表示用△prfA、+prfA和+prfA*喂飼的線蟲(chóng)相對(duì)于野生株EGDe喂飼的線蟲(chóng)在發(fā)育周期、壽命和產(chǎn)卵數(shù)方面的差異顯著性，其中c≤ 0.05, d≤ 0.01

2.2.2 線蟲(chóng)蟲(chóng)齡對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌致病性的影響 在以線蟲(chóng)為模型研究病原細(xì)菌致病性的實(shí)驗(yàn)中，通常采用L4期線蟲(chóng)。因?yàn)長(zhǎng)4期線蟲(chóng)處于線蟲(chóng)發(fā)育生命周期的晚期，其免疫能力可能較弱，易受致病菌的感染[4]。為了檢驗(yàn)蟲(chóng)齡是否影響李斯特菌的致病能力，比較了Lm野生株EGDe和高毒力突變株+prfA*喂飼L4期和L2期線蟲(chóng)時(shí)生存曲線的差異。如圖2所示，無(wú)論是以EGDe還是以+prfA*為食，處于發(fā)育周期中期的L2期線蟲(chóng)的生存時(shí)間均比L4期線蟲(chóng)略長(zhǎng)，生存率增加，說(shuō)明線蟲(chóng)的蟲(chóng)齡對(duì)線蟲(chóng)的生存長(zhǎng)短有重要影響。但是，高毒力的+prfA*喂飼L4期線蟲(chóng)時(shí)的生存率卻明顯比野生株EGDe喂飼L2期線蟲(chóng)時(shí)要高，表明高毒力的Lm不能破壞線蟲(chóng)的免疫機(jī)制，單核細(xì)胞增生李斯特菌的毒性高低與線蟲(chóng)蟲(chóng)齡大小沒(méi)有相關(guān)性，線蟲(chóng)蟲(chóng)齡對(duì)李斯特菌的致病能力沒(méi)有影響。

圖2 單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe和+prfA*喂飼L4期和L2期線蟲(chóng)時(shí)的生存曲線Fig.2 The survival curves of middle-aged (L2) and elderly worms (L4) fed on L. monocytogenes EGDe and +prfA*

2.2.3 單核細(xì)胞增生李斯特菌喂飼線蟲(chóng)時(shí)，線蟲(chóng)體表、消化道和糞便中的細(xì)菌數(shù) 研究表明，當(dāng)用大腸埃希菌OP50喂飼線蟲(chóng)時(shí)，OP50首先被線蟲(chóng)咽的表皮結(jié)構(gòu)磨碎后吞食，線蟲(chóng)的腸內(nèi)看不到完整的大腸埃希菌，也不能在線蟲(chóng)的消化道檢出完整的細(xì)菌[1]。盡管以上實(shí)驗(yàn)表明Lm不能致死線蟲(chóng)，甚至能顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)的發(fā)育周期和壽命，但Lm與線蟲(chóng)的相互關(guān)系，以及Lm能否作為線蟲(chóng)的良好食源且被線蟲(chóng)消化完全，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

表2 單核細(xì)胞增生李斯特菌喂飼線蟲(chóng)時(shí)，線蟲(chóng)體表、消化道和糞便中的細(xì)菌數(shù)

注：a、b表示與野生型EGDe相比，用△prfA和+prfA*喂飼線蟲(chóng)時(shí)，線蟲(chóng)體表、消化道和糞便中細(xì)菌數(shù)的差異顯著性，其中a≤ 0.05，b≤ 0.01

如表2所示，當(dāng)用Lm野生株EGDe、弱毒株△prfA和高毒力突變株+prfA*喂飼線蟲(chóng)后，從線蟲(chóng)體表可以發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)菌，其中以+prfA*最多，而△prfA最少；當(dāng)經(jīng)過(guò)60 μg/mL慶大霉素的充分處理，去掉了未被攝食的體表李斯特菌后，從線蟲(chóng)消化道中仍然可以檢出大量活細(xì)菌，其中EGDe的數(shù)量最多，而+prfA*最少；但當(dāng)與線蟲(chóng)體表和消化道中檢出的活菌數(shù)相比，線蟲(chóng)糞便活細(xì)菌數(shù)大為減少。以上結(jié)果表明：線蟲(chóng)能夠以Lm為食；Lm被線蟲(chóng)攝食后，并不被立即完全消化，可以在線蟲(chóng)消化腸道中存活一段時(shí)間；Lm毒性強(qiáng)弱與在線蟲(chóng)體表和消化腸道的生存沒(méi)有相關(guān)性。

3 討 論

在人類病原細(xì)菌致病機(jī)制的基礎(chǔ)研究中，選擇合適的模式宿主至關(guān)重要。近年來(lái)，秀麗隱桿線蟲(chóng)以其背景資料豐富、便于操作和觀察、廉價(jià)等特點(diǎn)，成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，但唯有病原菌可以對(duì)線蟲(chóng)致病，線蟲(chóng)才有可能作為研究病原菌致病性的模型。本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲(chóng)N2的良好食源大腸埃希菌OP50以及無(wú)害李斯特菌為參照，比較研究了食源性致病菌單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe及其毒力調(diào)控蛋白PrfA突變株對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)N2的致病作用。研究發(fā)現(xiàn)與無(wú)害李斯特菌一樣，Lm及其PrfA突變株不僅不能使線蟲(chóng)死亡，而且還能顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)的發(fā)育周期和壽命，這在一定程度上暗示Lm對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)沒(méi)有顯著致病性，不適合作為研究Lm致病機(jī)制的模型。

Lm對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)非致死性，是否是因?yàn)榕囵B(yǎng)線蟲(chóng)的溫度(25 ℃)不適合Lm毒力基因的表達(dá)？已知的研究證明，Lm在環(huán)境溫度低于30 ℃時(shí)侵染能力較低， 可能是因?yàn)閺膒rfA 啟動(dòng)子P1轉(zhuǎn)錄合成的mRNA非翻譯5′端 (untranslated 5′-region)在溫度低于30 ℃時(shí)，能折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu), 掩蓋了核糖體結(jié)點(diǎn)，從而阻礙PrfA的合成；而在溫度高于30 ℃時(shí)，不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，PrfA能夠順利合成，這就是所謂的“核糖體開(kāi)關(guān)機(jī)制”[9]。該發(fā)現(xiàn)能夠解釋Lm毒力基因在自然界和感染宿主后差異表達(dá)的現(xiàn)象。即：當(dāng)Lm在土壤環(huán)境(一般為室溫25 ℃左右)中以腐爛的植物為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行腐生生活時(shí)，毒力基因表達(dá)量較低；而當(dāng)Lm侵染入人體細(xì)胞后(一般為37 ℃)，毒力基因表達(dá)大大提高。然而，盡管Lm主要的危害是造成人和牲畜的李斯特菌病，但該菌還能侵染大蠟螟和果蠅等生活環(huán)境溫度通常在30 ℃以下的昆蟲(chóng)及其細(xì)胞系，暗示：“核糖體開(kāi)關(guān)機(jī)制”不能完全詮釋Lm毒力基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，溫度不是影響Lm對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)非致死性的唯一原因。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，改變PrfA蛋白鏈上的關(guān)鍵氨基酸的組成也可以影響PrfA的活性，進(jìn)而增強(qiáng)或者降低依賴PrfA調(diào)控的毒力基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中所采用的PrfA突變株+prfA*就是PrfA上第145位的甘氨酸替換為絲氨酸后產(chǎn)生的突變株，該突變極大地增強(qiáng)了PrfA與靶DNA的結(jié)合能力，導(dǎo)致PrfA的活性不再受溫度等培養(yǎng)條件的影響，使PrfA蛋白組成性高表達(dá)[9]，從而大大提高了突變株的致病能力。然而，本研究結(jié)果卻顯示，+prfA*和Lm野生株以及PrfA缺失株一樣，不僅不能造成秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡，反而能極其顯著地延長(zhǎng)線蟲(chóng)的發(fā)育周期和壽命，說(shuō)明這些在動(dòng)物毒理實(shí)驗(yàn)中已知高毒性的Lm菌株對(duì)線蟲(chóng)沒(méi)有顯著致病性，再次證明了線蟲(chóng)不是研究單核細(xì)胞增生李斯特菌致病機(jī)制的良好模型。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)可以從線蟲(chóng)消化道檢出大量活Lm細(xì)菌，而在糞便中檢出的活菌極少，表明線蟲(chóng)可以以Lm為食，但與線蟲(chóng)的良好食源大腸埃希菌OP50不同，Lm被線蟲(chóng)攝食后，似乎并不被立即磨碎消化，而能在消化道存活一段時(shí)間，直到被完全消化而排出細(xì)胞殘?jiān)?，暗示Lm并不是線蟲(chóng)的良好食源，這也與本研究觀察到的線蟲(chóng)喜食大腸埃希菌OP50的結(jié)果一致(移動(dòng)到OP50的線蟲(chóng)數(shù)目大約是移動(dòng)到李斯特菌的線蟲(chóng)數(shù)目的6倍)。因此，當(dāng)線蟲(chóng)以Lm為唯一食源時(shí)，線蟲(chóng)可能因不喜食用李斯特菌而處于一定程度的饑餓狀態(tài)，而這種饑餓狀態(tài)已被證明可以延長(zhǎng)線蟲(chóng)的發(fā)育周期和壽命[10]。同時(shí)，由于Lm和線蟲(chóng)均能在土壤環(huán)境中廣泛存在，Lm對(duì)線蟲(chóng)的非致死性，也可能有助于Lm借助線蟲(chóng)在土壤環(huán)境中生存和傳播。因此，鑒于Lm在食品衛(wèi)生安全中的重要影響以及線蟲(chóng)在模式生物研究中的作用，進(jìn)一步深入研究線蟲(chóng)與Lm的相互關(guān)系將對(duì)解析食源性致病微生物在自然環(huán)境中的進(jìn)化和傳播機(jī)制具有重要意義。

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Pathogenicity of Listeria monocytogenes against Caenorhabditis elegans

GUO Xin-xin, YU Xin-hui, ZHANG Ying, LUO Qin

(HubeiKeyLab.ofGen.Regulat’n&Integrat.Biol.,Coll.ofLifeSci.,Cent.ChinaNormalUni.,Wuhan430079)

Listeriamonocytogenes(Lm) is a pathogenic bacterium of listeriosis. In this study wild type ofLmEGDe, attenuated strain ΔprfA, PrfA complementary strain +prfA, and a highly virulent strain +prfA*were fed respectively to model organism ofCaenorhabditiselegans(Ce) N2, at the same time, fine food resource ofE.coliOP50 and non-pathogenic and unharmfulL.innocuawas also fed to the model of Ce as a control, to determine the effect ofLmon the development circle, life-span and brood ofC.elegans. The results showed that when fed on unharmfulL.innocua, wild-typeLmEGDe and its PrfA mutant strains, although the brood was slightly decreased, however, the nematode not only could normally oviposit, but also the development period and life-span ofC.eleganswere significantly extended (P≤0.05) as compared with those fed onE.coliOP50. Furthermore, a large number of liveLmcells were detected from the worms’ surface and digestive tract, but only a few bacteria were detected in the worms’ excrements. The above results indicated thatLmneither can kill Ce nor have significant pathogenicity against Ce, therefore,C.elegansis not a suitable model to study Listeria pathogenicity.C.eleganscan exist inLmbody surface and digestive tracts, suggested thatLmcould exist and spreading in soil environment with the aid of nematode.

Listeriamonocytogenes;Caenorhabditiselegans; PrfA; Pathogenicity; model system

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970111，31571931)

郭欣欣 女，碩士研究生。主要研究方向?yàn)槲⑸锓肿由飳W(xué)。E-mail:939209685@qq.com

* 通訊作者。女，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)椴≡⑸?。Tel: 027-67867221，E-mail:qinluo@mail.ccnu.edu.cn

2014-06-16；

2014-09-04

Q939.96

A

1005-7021(2015)04-0007-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.002