王曉紅， 范學財，2， 張吉生， 王 勇， 郭宇航， 曼 薩， 張曉麗*

(1.佳木斯大學 附屬第一醫(yī)院 檢驗科，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學 附屬第二醫(yī)院 檢驗科，黑龍江 佳木斯 154003)

?

鮑曼不動桿菌的耐藥情況及碳青霉烯酶基因檢測

王曉紅1， 范學財1，2， 張吉生1， 王 勇1， 郭宇航1， 曼 薩1， 張曉麗1*

(1.佳木斯大學 附屬第一醫(yī)院 檢驗科，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學 附屬第二醫(yī)院 檢驗科，黑龍江 佳木斯 154003)

了解佳木斯大學附屬第一醫(yī)院鮑曼不動桿菌耐藥性及碳青霉烯酶包括苯唑西林酶和金屬酶相關耐藥基因分布情況，為臨床抗菌藥物的合理選擇提供依據(jù)。2013年9月至2014年12月使用VITEK-II全自動微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)篩選出佳木斯大學附屬第一醫(yī)院臨床標本鮑曼不動桿菌69株；采用多重PCR方法檢測鮑曼不動桿菌攜帶的碳青霉烯酶相關耐藥基因16S rRNA、OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP、VIM、SIM，并對耐藥基因擴增的陽性產(chǎn)物進行DNA 序列分析。69株AB對亞胺培南、美洛培南的耐藥率分別為36.2%、37.68%，對其他抗菌藥物的耐藥率均高于50%。6種耐藥基因的檢測結果為69株(100%) 攜帶OXA-51基因，32株(46.4%) 攜帶OXA-23基因，17株(24.6%) 攜帶OXA-24基因，5株(7.2%)攜帶OXA-58基因，1株(1.4%)攜帶IMP基因。25株碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動桿菌中，22株(88%) 攜帶OXA-23，1株(4%) 攜帶OXA-58，10株(40%) 攜帶OXA-24，6株(24%)同時攜帶OXA-23、OXA-24。 DNA 序列分析結果顯示：OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58分別與NCBI 的序列同源性均為99%。產(chǎn)OXA-23 型碳青霉烯酶可能是佳木斯大學附屬第一醫(yī)院鮑曼不動桿菌對碳青霉烯酶類抗菌藥物耐藥的主要原因，另外佳木斯大學附屬第一醫(yī)院存在OXA-24型耐藥基因鮑曼不動桿菌的區(qū)域性流行。

鮑曼不動桿菌；碳青霉烯酶；耐藥性；耐藥基因；苯唑西林酶(OXA)

目前多重耐藥和泛耐藥的鮑曼不動桿菌檢出率逐年升高，其感染率、耐藥率及臨床致死率也日趨嚴重，引起廣泛關注[1]。碳青霉烯類抗菌藥物是迄今抗菌譜最廣、抗菌活性最強的一類高效、廣譜的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物[2]。伴隨碳青霉烯類抗菌藥物的臨床應用，使耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌(Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)不斷出現(xiàn)并廣泛傳播[3-4]。碳青霉烯酶能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物成為碳青霉烯類抗菌藥物的主要耐藥機制之一[5]。為了解鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶相關耐藥基因存在情況，本研究對佳木斯大學附屬第一醫(yī)院2013年至2014年臨床分離的69株鮑曼不動桿菌的苯唑西林酶和金屬酶基因進行檢測并分析。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源 佳木斯大學附屬第一醫(yī)院2013年9月至2014年12月臨床分離的鮑曼不動桿菌共69株，除去重樣本，全部菌株用Vitek II Compact(法國生物梅里埃公司)進行菌種鑒定及體外藥物敏感性分析。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參考文獻[6]合成引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

1.2.2 DNA模板制備 用煮沸法制備DNA模板。細菌菌落懸浮于8.5 g/L NaCl中至5個麥氏單位, 13 000 r/min離心2 min，重懸于200 μL的無菌雙蒸水， K10CD干式恒溫器煮10 min，13 000 r/min離心10 min，上清液DNA保存20 ℃。

1.2.3 PCR擴增及DNA測序 多重PCR檢測OXA酶基因(blaOXA-23-like、 blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、blaOXA-58-like)反應體系：Platinum Multiplex PCR Master Mix 12.5 μL，Primer(10 μmol/L) 0.2 μL，Template DNA 1 μL，GC Enhancer 2 μL。反應條件: 95 ℃ 2 min；(95 ℃ 30 s，60 ℃ 90 s，72 ℃ 60 s)35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。16S rRNA、IMP、SIM、VIM反應體系：5×buffer 5 μL, 10 μmol/L dNTP 0.5 μL, 5 U/μLTaq0.2 μL, 10 μmol/L Primer mix 1 μL, 2 ng/μL DNA模板 1 μL。反應條件: 94 ℃，5 min；(94 ℃ 30 s， 58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s)35個循環(huán)； 72 ℃ 10 min，4 ℃保存。5 μL PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。PCR產(chǎn)物由哈爾濱博仕生物有限公司進行純化并雙向測序，序列與GenBank blast比對進行同源性分析。

表1 擴增各種OXA 及MBL碳青霉烯酶基因的引物序列

2 結果與分析

2.1 標本來源及臨床分布

經(jīng)16S rRNA陽性鑒定,69株均為鮑曼不動桿菌，標本主要來源于痰標本79.7%，其余來自腦脊液、分泌物、血液和傷口膿液分別為10.1%、4.3%、4.3%和1.4%。來源科室ICU 檢出率最高，其次為呼吸科和急診科， 分別為17.4%、14.5%和14.5%。

2.2 鮑曼不動桿菌耐藥性

鮑曼不動桿菌的耐藥表型結果：69株菌中亞胺培南、美洛培南的耐藥株數(shù)(耐藥率)分別為25株(36.2%)、26株(37.7%)，其余抗生素耐藥率均高于50%。

2.3 碳青霉烯酶基因檢測結果

69株(100%) 攜帶OXA-51基因，32株(45.5%) 攜帶OXA-23基因，17株(24.6%) 攜帶OXA-24基因，5株(7.2%)攜帶OXA-58基因，1株(1.4%)攜帶IMP基因。其中同時含有OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58四種基因的標本2株，OXA-51、OXA-23、OXA-24三種基因陽性標本12株，OXA-51、OXA-58同時陽性樣本3株，OXA-51、OXA-24同時陽性樣本3株，OXA-51、OXA-23同時陽性樣本18株(圖1)。含有DNA 序列分析結果顯示:OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58分別與NCBI 的序列同源性均為99%。經(jīng)測序與GenBank公布的核酸序列99%同源。

圖1 多重PCR檢測OXA基因電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of OXA gene DNA by Multiplex PCR method

12～44：樣本序號；39：陰性對照；M：DNA marker

12～44：indicate samples number; 39：indicates negative control; M：indicates DNA marker

25株碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動桿菌中，22株(88%) 攜帶OXA-23，1株(4%) 攜帶OXA-58，10株(40%) 攜帶OXA-24，6株(24%)同時攜帶OXA-23、OXA-24。另外將OXA-24基因與NCBI Blast 比對后發(fā)現(xiàn)為OXA-72亞基因型(圖2)。

圖2 OXA-24序列 NCBI Blast 比對結果Fig.2 Sequence alignment of OXA-24 by NCBI Blast

3 討 論

1991年，美國報道了首例對碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌，隨之世界各地相繼出現(xiàn)鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥且逐年增高， 研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性與產(chǎn)碳青霉烯酶關系密切。碳青霉烯酶主要是Ambler 分子結構分類法中的B類和D類β-內(nèi)酰胺酶， B類酶就是金屬酶(metallo-beta-lactamases，MBLs) ，能高效水解β-內(nèi)酰胺類藥物，發(fā)揮活性需要金屬離子Zn2+，獲得性金屬酶可分為5型IMP、VIM、SIM、SPM和GIM[7-8]， 國內(nèi)金屬酶分離率遠遠低于blaOXA基因的分離率，本研究對前三型進行檢測，檢測出1株IMP基因陽性株，IMP陽性株對亞胺培南體外敏感，說明其介導耐藥可能與I類整合子相關。

D類酶又稱苯唑西林酶(Oxacillin-hydrolyzing, OXA)，因其可水解苯唑西林而命名，其催化機制是在絲氨酸催化底物和酶形成一個共價?；虚g產(chǎn)物，并隨后脫?；功?內(nèi)酰胺環(huán)上C-N連接水解，導致藥物失活[9]，發(fā)現(xiàn)主要包括6個亞組，分別為OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、OXA-143和最近發(fā)現(xiàn)的OXA-235[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)同時攜帶OXA-51和OXA-23基因的菌株對碳青霉烯類抗生素抗菌藥物的耐藥率達到87.5%，呈現(xiàn)多重耐藥和廣泛耐藥，提示攜帶OXA-23基因可能是導致鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制之一，這與其他國內(nèi)外報道一致[11]。另外本研究中發(fā)現(xiàn)14株鮑曼不動桿菌含有OXA-24基因，我國大部分地區(qū)以OXA-51、OXA-23為組，OXA-24檢出極少[12]，OXA-24曾在歐洲包括美國、西班牙、德國、韓國、克羅地亞等地暴發(fā)[13-15]，2004年我國臺灣首次報道OXA-24產(chǎn)酶株之后，我國大陸地區(qū)2006年也發(fā)現(xiàn)同亞型株[11]。OXA-24亞組包括OXA-40(與OXA-24相似)、OXA-25、OXA-26和OXA-72，本研究檢測出的OXA-24基因測序后Blast比對與OXA-72 同源性為99%，是否說明我國黑龍江東部地區(qū)有局部范圍OXA-72鮑曼不動桿菌流行有待進一步研究，其樣本來源包括ICU、急診、神經(jīng)外科、神經(jīng)內(nèi)科、呼吸科、血液科、放化療等科室，科室分散，但CRAB中攜帶OXA-24的菌株中有40%，其與碳青霉烯酶等抗生素多重耐藥可能相關。OXA-58組主要是OXA-58和OXA-97，是一種新的質(zhì)粒介導的D類酶，與OXA-51的同源性約59%，能水解青霉素、苯唑西林和亞胺培南，但不能水解頭孢菌素類[16]。本研究結果中OXA-58基因檢出率較低，且僅有1株攜帶OXA-58基因為亞胺培南耐藥。

本研究中鮑曼不動桿菌檢測結果以攜帶OXA-23基因為主且耐藥性較強，另外發(fā)現(xiàn)有部分菌株攜帶OXA-24基因，為本地區(qū)鮑曼不動桿菌的流行病學研究提供科學依據(jù)。當鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥時，臨床醫(yī)師可選擇藥物會更少。因此，在臨床上應重視預防對碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌的傳播且合理選用抗菌藥物治療。

[1] 陳淑蘭, 李正軍, 路娟, 等.重癥監(jiān)護病房醫(yī)院感染菌分布與耐藥性分析[J]. 微生物學雜志, 2012, 32(1):100-105.

[2] Chopra T, Marchaim D, Awali RA, et al.Epidemiology of bloodstream infections caused by Acinetobacter baumannii and impact of drug resistance to both carbapenems and ampicillin-sulbactam on clinical outcomes [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(12): 6270-6275.

[3] Kempf M, Rolain JM.Emergence of resistance to carbapenems in Acinetobacter baumannii in Europe: clinical impactand therapeutic options[J].Int J Antimicrob Agents, 2012, 39(2):105-114.

[4] Gordon NC, Wareham DW. Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii: mechanisms of virulence and resistance[J]. Int J Antimicrob Agents，2010, 35(3):219-226.

[5] Joly-Guillou M L. Clinical impact and pathogenicity of Acinetobacter [J]. Clin Microbiol Infect, 2005, 11(11): 868-873.

[6] Woodford N.，Ellington M.J.，Coelho J.M., et al. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases inAcinetobacterspp.[J]. Int .J.Antimicrob Agents, 2006, 27:351-353.

[7] Shanthi J, Balagurunathan R. Characterisation of heteroresistant subcolonies for MBL,AmpC genes inKlebsiellapneumoniaeandAcinetobacterbaumannii[J] Indian J Med Microbiol,2014，32(2):210-211.

[8] Yang HY，Lee HJ，Suh JT，et al． Outbreaks of imipenem resistantAcinetobacterbaumanniiproducing OXA-23 beta-lactamase in a tertiary care hospital in Korea[J]. Yonsei Med J,2009, 50(6) :764-770.

[9] 鄧德耀, 袁文麗, 劉春林,等. OXA-51型β-內(nèi)酰胺酶的研究進展[J].中國感染與化療雜志, 2014, 14(5):451-454.

[10]Ayse NS, Meral B, Zeynep G, et al. The first report on the outbreak of OXA-24/40-like carbapenemase-producingAcinetobacterbaumanniiin Turkey[J]. Japanese journal infectious diseases, 2013,66:439-442.

[11]Hui Wang, Ping Guo,Hongli Sun, et al. Molecular Epidemiology of Clinical Isolates of Carbapenem-ResistantAcinetobacterspp. from Chinese Hospitals[J].Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(11):4022-4028.

[12]蔡培泉, 李明玲, 王春新, 等. 同時攜帶TEM-1、ADC-57、DHA-1、OXA-23 4種β-內(nèi)酰胺酶基因的泛耐藥鮑曼不動桿菌的發(fā)現(xiàn)[J].中國抗生素雜志, 2013, 38(11):S4-S8.

[13]Joshi Acosta,María Merino, Esther Viedma, et al.Multidrug-ResistantAcinetobacterbaumanniiHarboring OXA-24 Carbapenemase, Spain[J]. Emerging Infectious Diseases,2011, 17(6): 1064-1067.

[15]Vrani＇c-Ladavac M, Bedeni＇c B, Minandri F, et al. Carbapenem resistance and acquired class D beta-lactamases inAcinetobacterbaumanniifrom Croatia 2009-2010[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33(3):471-478.

[16]董方, 徐樨巍, 宋文琪, 等.兒科臨床分離多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥性和產(chǎn)OXA酶的研究[J]. 中國感染與化療雜志, 2011,11(6):463-466.

Carbapenemase Gene Detection of Acinetobacter baumannii in the Hospital

WANG Xiao-hong1, FAN Xue-cai1，2, ZHANG Ji-sheng1,WANG Yong1, GUO Yu-hang1, SEDZRO Divine Mensal1, ZHANG Xiao-li1

(1.Dept.ofLab, 1st.Affil.Hosp.,JiamusiUni,Jiamusi154007; 2.Dept.ofLab, 2ndAffil.Hosp.,JiamusiUni.,Jiamusi154003)

In order to understand the distribution ofAcinetobacterbaumanniidrug-resistance and carbapenemase including oxacillinase (OXA) and metalloenzyme (MLE) related resistance genes in the affiliated hospitals of Jiamusi University to provide a foundation for reasonable choice of clinical antibiotic medicine. 69A.baumanniistrains were collected and screened in the hospital clinical samples identified by VITEK-II full-automatic microbial identification/susceptibility testing machine from September 2013 to December 2014. Multiplex PCR detection method was used to detect carbapenemase related resistant genes 16S rRNA, OXA-23, OXA-24, OXA-51, OXA-58, IMP, VIM and SIM. The positive amplified products were subjected to DNA sequence analysis. The results showed that the resistant rate of 69 strains to IMP and MEM were 36.2% and 37.68%. The resistant gene was obtained as follows: 69 (100%) carrying OXA-51 gene, 32 (46.4%) carrying OXA-23 gene, 17 (24.6%) carrying OXA-24 gene, 5 (6.8%) carrying OXA-58 genes. Out of 25 carbapenem resistant strains ofA.baumanniiidentified, 22 (88%) carried OXA-23, 1 (4%) carried OXA-58, 10 (40%) carried OXA-24, and 6 (24%) carried both OXA-23 and OXA-24. DNA sequence analysis of OXA-23, OXA-24, OXA-51 and OXA-58 with the NCBI sequence showed 99% homology. Therefore, the OXA-23 gene producer may be responsible for the main reason ofA.baumanniicarbapenemase antibiotic resistance. Moreover, there exists regional epidemic of OXA-24 drug resistant geneA.baumanniiin the hospital.

Acinetobacterbaumannii; carbapenemase; drug resistance; resistant gene；oxacillinase

黑龍江省自然科學基金項目(D201224)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目(2013-226)；佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目(LZZ2014_022)

王曉紅 女，副主任技師。研究方向為臨床微生物耐藥機制的研究。Tel:0454-8606771，E-mail:xiaolizhangcmu@yeh.net

* 通訊作者。女，副教授，博士，碩士研究生導師。研究方向為臨床微生物耐藥機制的研究。Tel:0454-8801816，E-mail: jmszxl@163.com

2015-03-12；

2015-04-14

Q939.93; R378.991

A

1005-7021(2015)04-0059-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.011