徐昌隆，王建嶂，鄭波，曹曙光，吳昊，薛戰(zhàn)雄

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T、A1298C多態(tài)性與胃癌的關(guān)系

徐昌隆，王建嶂，鄭波，曹曙光，吳昊，薛戰(zhàn)雄

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

目的：探討亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T和A1298C基因多態(tài)性與浙江漢族人群胃癌的關(guān)系。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RELP）技術(shù)，檢測(cè)112例胃癌患者和218例正常對(duì)照者的MTHFR C677T及A1298C基因多態(tài)性分布差異。結(jié)果：MTHFR C677T的突變等位基因T及變異基因型（CT+TT）頻率在胃癌組和對(duì)照組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（34.82% vs 32.57%和53.57% vs 52.75%，均P＞0.05）。胃癌組MTHFR A1298C突變等位基因C明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（21.43% vs 12.39%，P=0.006，0R=1.929，95%CI：1.325～2.873），而2組間突變基因型（AC+CC）頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（32.15% vs 36.24%，P＞0.05）。結(jié)論：浙江漢族人群MTHFR A1298C突變等位基因C可能與胃癌的易感性有關(guān)。

亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；胃腫瘤

亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。MTHFR基因有兩個(gè)常見多態(tài)，即C677T及A1298C，其基因多態(tài)性最常見的改變是677C→T和 1298A→C的突變。這些突變使其編碼的MTHFR蛋白熱不穩(wěn)性及酶活性下降，導(dǎo)致總?cè)~酸水平降低，與包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[1-2]。國內(nèi)外有較多報(bào)道MTHFR基因多態(tài)性與胃癌關(guān)系的文獻(xiàn)[3-4]，但結(jié)論頗不一致。本研究運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在浙江漢族人群中探討MTHFR基因C677T及A1298C兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)的多態(tài)性與胃癌的關(guān)系，并分析眾多研究結(jié)論迥異的可能原因。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 2011年5月至2014年7月，在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科收集112例原發(fā)性胃癌患者為胃癌組，經(jīng)臨床、實(shí)驗(yàn)室、電子胃鏡及病理組織學(xué)確診，其中男74例，女38例，年齡（59.2±12.8）歲。同期在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心收集的218例健康體檢者為對(duì)照組，其中男147例，女71例，年齡（61±13.2）歲。胃癌組和對(duì)照組在性別、年齡構(gòu)成上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。以上研究對(duì)象均為無血緣關(guān)系的浙江漢族人群。所有入選對(duì)象均簽署知情同意書，研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取：取空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝。采用蛋白酶K消化，苯酚/氯仿/異戊醇法提取全基因組DNA（試劑盒購自上海捷瑞生物有限公司，按照說明書操作）。經(jīng)DNA定量儀測(cè)定后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和合成：參照文獻(xiàn)[5-6] 設(shè)計(jì)引物，MTHFR C677T引物序列：正義鏈5’-TGAAGGAGAAGGTGT CTGCGGGA-3’，反義鏈5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’；MTHFR A1298C引物序列：正義鏈5’-CTTTGGGGAGCTGA AGGACTACTAC-3’，反義鏈5’-CACTTTGTGACCATTCCGGTT TG-3’。由上海生物工程有限公司合成。

1.2.3 MTHFR C677T、A1298C基因多態(tài)性檢測(cè)：采用限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RELP）PCR法檢測(cè)MTHFR C677T和A1298C基因多態(tài)性。①C677T擴(kuò)增體系與基 因多態(tài)性分析：PCR反應(yīng)體系50μL，含正反義鏈引物 （10 pmol/L）各1.5μL，MgCl2（25 mmol/L）3μL，dNTPs（10 mmol/L）2μL，10×buffer 5μL，Taq酶 2.5 U（1 U/μL），模板DNA 2μL（約20～40 ng/μL）， 滅菌雙蒸水32.5μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè) 循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用Hinf I（MBI Fermentas，USA）37 ℃酶切過夜，再用10%聚丙烯酰 胺凝膠電泳（PAGE）檢測(cè)。②A1298C擴(kuò)增體系與基因多態(tài)性分析：PCR反應(yīng)體系25μL，含正反義鏈引物（10 pmol/L）各1μL，MgCl2（25 mmol/L）2μL，dNTPs（10 mmol/L）1μL，10×buffer 2μL，Taq酶 1 U（1 U/μL），模板DNA 1μL（約20～40 ng/μL），滅菌雙蒸水16μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè) 循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物加Mbo I I（MBI Fermentas，USA）37 ℃酶切過夜，用12% PAGE檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。Hardy-Weinberg平衡規(guī)律使用卡方檢驗(yàn)，分類變量運(yùn)用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，以比值比（OR）及95%可信區(qū)間（CI）表示相對(duì)危險(xiǎn)度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR C677T、A1298C基因位點(diǎn) MTHFR C677T正常等位基因C對(duì)應(yīng)198 bp 1條帶，突變等位基因T為175、23 bp 2條帶，其中23 bp條帶泳出膠外，故以198 bp為CC基因型，175 bp為TT基因型，CT基因型有198 bp與175 bp 2條片段帶，見圖1。MTHFR A1298C正常等位基因A對(duì)應(yīng)56、31、30、28和18 bp， 突變等位基因C對(duì)應(yīng)84、31、30和18 bp，電泳時(shí)31、30、28和18 bp片段帶泳出膠外，故分別判56 bp 為AA型、84 bp為CC型、有56 bp和84 bp 2條片段帶為AC型，見圖2。上述基因位點(diǎn)的部分PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后作為陽性對(duì)照，以輔助判斷基因型（上海浦生生物技術(shù)有限公司），見圖3-4。

圖1 MTHFR C677T酶切產(chǎn)物電泳圖

圖2 MTHFR A1298C酶切產(chǎn)物電泳圖

圖3 MTHFR C677T測(cè)序圖

圖4 MTHFR A1298C 測(cè)序圖

2.2 MTHFR C677T基因型和等位基因在胃癌組和對(duì)照組的分布 胃癌組和對(duì)照組MTHFR C677T基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律（P＞0.05），樣本具有群體代表性。MTHFR C677T的突變等位基因T及變異基因型（CT+TT）頻率在胃癌組和對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為34.82% vs 32.57%，P=0.363，OR=1.106，95%CI：0.763～1.158； 53.57% vs 52.75%，P=0.654，OR=1.033，95%CI：0.812～1.237），見表1。

2.3 MTHFR A1298C基因型和等位基因在胃癌組和對(duì)照組中的分布 胃癌組和對(duì)照組MTHFR A1298C基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律（P＞0.05），樣本具有群體代表性。胃癌組MTHFR A1298C突變等位基因C明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （21.43% vs 12.39%，P=0.006，OR=1.929，95%CI：1.325～2.873）。而2組間突變基因型（AC+CC）頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（32.15% vs 36.24%，P=0.762，OR=0.834，95%CI：0.786～2.115），見表2。

表1 MTHFR C677T基因多態(tài)性在胃癌組和對(duì)照組中的分布 n（%）

表2 MTHFR A1298C基因多態(tài)性在胃癌組和對(duì)照組中的分布 n（%）

3 討論

MTHFR能催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸。MTHFR編碼基因位于染色體1p36.3，存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。其中C677T多態(tài)性位于MTHFR基因第4外顯子，該位點(diǎn)胞嘧啶（C）突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）后，使MTHFR的熱不穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致該酶活性降低。A1298C位于MTHFR基因第7外顯子，該位點(diǎn)發(fā)生A→C突變后，引起MTHFR催化活性降低。體外基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，攜帶677TT純合子基因型、1298AC雜合子基因型以及（677CT+1298AC）復(fù)合雜合子基因型的個(gè)體，其體內(nèi)MTHFR酶活性分別降低45%，68%和41%[7]。近期有報(bào)道，677CT和677TT變異基因型頻率較高人群的血清葉酸濃度顯著降低[8]。因此，這些突變引起的血漿葉酸水平降低，可通過破壞DNA甲基化、合成和修復(fù)發(fā)揮致癌作用，增加包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性。

本研究顯示，胃癌組與對(duì)照組之間突變基因型（AC+CC）頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而胃癌患者M(jìn)THFR A1298C位點(diǎn)突變等位基因C的頻率明顯高于對(duì)照組，提示MTHFR Al298C可能是浙江漢族人群胃癌的易感基因。在相關(guān)Meta分析[4，9-10]中，雖均顯示胃癌患者與健康對(duì)照之間MTHFR A1298C的突變基因型（AC+ CC）頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其中Lv等[9]和Dong 等[10]還顯現(xiàn)兩人群間突變等位基因C差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故皆認(rèn)為A1298C基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生無關(guān)，與本研究的結(jié)果有異。本研究顯示的MTHFR C677T的突變等位基因T及變異基因型（CT+TT）頻 率在胃癌組和對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與翁玉蓉等[11]的報(bào)道相同，可表明MTHFR C677T多態(tài)性與胃癌的發(fā)生無明顯關(guān)聯(lián)。但是與此結(jié)論相反的，包括相關(guān)Meta分析的報(bào)道[1，3，9-10，12]頗多，都明確提示攜帶MTHFR 677 CT和677 TT基因型以及T等位基因的個(gè)體顯著增加胃癌的易感性。經(jīng)查閱文獻(xiàn)還發(fā)現(xiàn)有與前述皆迥異的報(bào)道，如MTHFR C677T和A1298C多態(tài)性均與胃癌的發(fā)生無關(guān)[13]，以及MTHFR 677 TT基因型和MTHFR 1298 CC基因型都能顯著降低患癌癥風(fēng)險(xiǎn)[14]。

綜上，可以看出MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因多態(tài)性與胃癌易感性關(guān)系的結(jié)論差異很大，甚至不少是相互矛盾的。由于這些不一致的結(jié)果來自不同種族、不同地區(qū)、不同方法的獨(dú)立研究，Meta分析也只是表達(dá)了這些相同目的的多個(gè)獨(dú)立研究結(jié)果的合并效應(yīng)量。故諸多研究結(jié)果的差異，似可主要?dú)w因于種族差異、研究方法不同、地域相異或某些研究還有對(duì)象樣本量不夠大所致。此外，尤其值得考慮的是MTHFR基因突變致癌是通過降低血漿葉酸水平而起作用的，研究對(duì)象個(gè)體的葉酸狀態(tài)（包括葉酸攝入，血漿、血細(xì)胞和組織的葉酸含量）很有可能是造成上述結(jié)果矛盾的重要原因?？赡苁腔谶@種想法，新近有研究將葉酸攝入量作為條件來研究MTHFR基因多態(tài)性與胃癌的關(guān)系，結(jié)果表明MTHFR 677 TT突變基因型和高葉酸攝入量對(duì)制約胃癌有保護(hù)作用[15]。

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（本文編輯：吳健敏）

Relationship between the methylenetetrahydrofolate reductase C677T,A1298C genetic polymorphisms and gastric cancer

XU Changlong,WANG Jianzhang,ZHENG Bo,CAO Shuguang,WU Hao,XUE Zhanxiong.
Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To evaluate the association between methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T,A1298C genetic polymorphisms and gastric cancer in Zhejiang Han nationality population.Methods:Select 112 cases of patients with gastric cancer,choose health check-up 218 cases as controls.The genetic polymorphisms of MTHFR (C677T and A1298C) were detected by PCR-RELP method.Results:There were no significant discrepancies of the mutational allele T and variant genotype (CT+TT) frequencies in the MTHFR C677T gene between the gastric cancer patients and the controls (34.82% vs 32.57% and 53.57% vs 52.75%,respectively,all P＞0.05).The frequency of mutational allele C in MTHFR A1298C gene was significantly higher in gastric cancer patients than that in the controls (21.43% vs 12.39%,P=0.006,OR=1.929,95%CI: 1.325～2.873).However,there were no significant discrepancies of the variant genotype frequencies (AC+CC) between the two groups (32.15% vs 36.24%,P＞0.05).Conclusion:The mutational allele C in MTHFR A1298C gene may be associated with the susceptibility to gastric cancer in Zhejiang Han nationality population.

methylenetetrahydrofolate reductase; genetic polymorphism; gastric neoplasms

R735.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.005

2015-01-03

溫州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（Y20110132）

徐昌?。?976-），男，浙江溫州人，副主任醫(yī)師，博士。

薛戰(zhàn)雄，主任醫(yī)師，Email：xuezhanxiong@163.com。