王錢東，吳淑娟，朱國文

（瑞安市人民醫(yī)院，浙江 溫州 325200，1.麻醉科；2.藥劑科）

·論 著·

嗎啡對(duì)順鉑誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞的生物學(xué)影響

王錢東1，吳淑娟2，朱國文1

（瑞安市人民醫(yī)院，浙江 溫州 325200，1.麻醉科；2.藥劑科）

目的：探討嗎啡聯(lián)合順鉑處理肺癌A549細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡水平的變化。方法：選擇不同濃度嗎啡處理肺癌A549細(xì)胞，CCK8法檢測(cè)6、12、24和48 h時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率；再采用30 μg/ mL順鉑單藥聯(lián)合篩選出的最佳抑制率濃度的嗎啡處理細(xì)胞，48 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，同時(shí)采用Western blot電泳檢測(cè)順鉑單藥、嗎啡，以及二者聯(lián)合分別處理細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、survivin表達(dá)量的變化。結(jié)果：CCK8法顯示500 μg/mL濃度的嗎啡單獨(dú)處理肺癌細(xì)胞48 h時(shí)，能最明顯抑制細(xì)胞的增殖（P＜0.05），抑制率達(dá)到41.2%；與單純使用順鉑抑制細(xì)胞增殖效果（47.21%）相比，順鉑30 μg/ mL聯(lián)合500 μg/mL嗎啡對(duì)細(xì)胞的抑制率達(dá)77.45%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot實(shí)驗(yàn)顯示順鉑聯(lián)合500 μg/mL嗎啡與單純順鉑藥物作用相比，Bcl-2、survivin蛋白表達(dá)量降低，Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)升高。結(jié)論：選擇合適的嗎啡濃度可加強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制增殖和促凋亡功能，這種對(duì)肺癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)可能與促進(jìn)凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)上調(diào)和凋亡抑制蛋白的下調(diào)相關(guān)。

嗎啡；順鉑；肺腫瘤；細(xì)胞生物學(xué)

晚期肺癌患者多數(shù)會(huì)伴有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移灶的癌癥疼痛[1]，作為主要鎮(zhèn)痛作用的阿片類藥物，人們?cè)桨l(fā)關(guān)注其鎮(zhèn)痛效應(yīng)以外的其他作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗肺癌作用。嗎啡作為阿片類代表藥為癌癥治療中第三階梯鎮(zhèn)痛用藥，除神經(jīng)元激活阿片受體信號(hào)的鎮(zhèn)痛機(jī)制外，大量研究表明嗎啡產(chǎn)生許多不依賴其鎮(zhèn)痛作用的生物學(xué)效應(yīng)并可能會(huì)影響細(xì)胞存活或增殖[2-4]。順鉑作為細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療具有重要的抗肺癌活性。癌癥患者常在接受化療的同時(shí)，予以鎮(zhèn)痛的對(duì)癥處理，那么在應(yīng)用化療藥物的肺癌治療過程中，嗎啡是否會(huì)對(duì)肺癌化療效果產(chǎn)生影響也成為關(guān)注的焦點(diǎn)[5-6]。因此，本研究提出嗎啡與順鉑聯(lián)合用藥，觀察其是否對(duì)肺癌細(xì)胞化療效果有增強(qiáng)作用，以及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)藥物 人源肺腺癌A549細(xì)胞株引自美國ATCC。臨床用嗎啡注射液（東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司），分裝成濃度分別為100、200、500和1 000 μg/mL的藥物懸液。順鉑（南京制藥廠有限公司），用前取0.3 mg，溶解于0.9%氯化鈉溶液10 mL中，配成終濃度為30 μg/mL的溶液，主要實(shí)驗(yàn)試劑有CCK-8試劑盒（世紀(jì)康為生物公司，中國），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，B480），GAPDH單抗（Santa Cruz公司，美國），Bax一抗（Santa Cruz公司，美國）；Bcl-2一抗（Santa Cruz公司，美國）；Caspase-3一抗（Santa Cruz公司，美國）；survivin一抗（Santa Cruz公司，美國）；HRP-羊抗兔IgG（Santa Cruz公司，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：從-196 ℃液氮中取出凍存的肺腺癌A549細(xì)胞，用含10% FBS、1%的青霉素-鏈霉素的改良型1640培養(yǎng)基均勻接種于10 cm dish中，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，間隔2 d更換培養(yǎng)液1次，于80%左右的細(xì)胞密度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，根據(jù)胎盤蘭染色判斷細(xì)胞活度，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期生長期時(shí)進(jìn)行藥物聯(lián)合處理。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞消化制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整細(xì)胞密度1×107/mL，按每孔約2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)皿中，接種過程中保持吹打和晃動(dòng)，使細(xì)胞分布盡量均勻，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（37 ℃，5% CO2），待細(xì)胞貼壁后吸除全部培養(yǎng)液，向培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的嗎啡藥物懸液，在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（本實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)為6、12、24和48 h），之后取出板子，向每孔加入10 μL CCK8溶液注意避光和不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。注意遮蓋培養(yǎng)板，避光保存在室溫條件下，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。細(xì)胞活力按照公式計(jì)算，細(xì)胞活力（%）=[OD（加藥）-OD（空白）]/[OD（0加藥）-OD（空白）]×100。根據(jù)嗎啡濃度梯度篩選最佳細(xì)胞處理濃度，依據(jù)此方法進(jìn)而計(jì)算嗎啡與順鉑藥物聯(lián)合處理后細(xì)胞的生長活力變化。

1.2.3 細(xì)胞處理后BCA法檢測(cè)各組蛋白表達(dá)情況：蛋白樣品制備分4組。①對(duì)照組：向培養(yǎng)液中加入1 mL 0.9%氯化鈉溶液；②嗎啡組：向培養(yǎng)液中加入500 μg/mL濃度的嗎啡注射液1 mL；③嗎啡聯(lián)合順鉑組：?jiǎn)岱群晚樸K劑量同單獨(dú)處理組，同時(shí)加入培養(yǎng)基中處理；④順鉑組：根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，順鉑藥物濃度設(shè)定為30 μg/mL，每10 cm dish培養(yǎng)液中加入順鉑混懸液1 mL。藥物處理細(xì)胞后于48 h時(shí)點(diǎn)收集細(xì)胞。加入適當(dāng)體積的冰上預(yù)冷的RIPA裂解液（用時(shí)加入PMSF、Coctail蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min，中途顛倒混勻3次；4 ℃，12 000 r/min離心14 min；吸取上清至新預(yù)冷的離心管中，即為蛋白樣品。取出25 μL蛋白樣品待定量使用，剩余樣品加入5×SDS loading buffer，沸煮10 min，瞬時(shí)離心。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，用1×SDS loading buffer補(bǔ)齊至各組同一濃度，即可上樣電泳，用完的蛋白樣品保存于-40 ℃冰箱中。

1.2.4 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞提取的蛋白Western blot電泳：制備10%分離膠和5%濃縮膠灌注，電泳緩沖液中80 V電泳，至Marker到分離膠分開后，加壓至120 V恒壓至溴酚藍(lán)跑完。轉(zhuǎn)膜：根據(jù)分離膠的大小剪一塊PVDF膜從負(fù)極到正極依次制作排列為海綿/濾紙/凝膠/膜/濾紙/海綿的折疊形狀狀，玻璃棒趕走膠與膜之間的氣泡，170 mA恒流電轉(zhuǎn)2 h。封閉：5%脫脂奶粉中，于60轉(zhuǎn)搖床上室溫封閉1 h。一抗孵育：5% BSA配制一抗（1∶3 000～1∶10 000），4 ℃緩慢搖動(dòng)過夜。TBST于150轉(zhuǎn)搖床上10 min/3次。加入二抗孵育液（1：4 000，生奶稀釋），室溫濕盒中孵育2 h。TBST于150轉(zhuǎn)搖床上10 min/3次。觀察結(jié)果：1∶1配制顯影液和穩(wěn)定劑，取200 μL試劑均勻覆蓋于剪好的膜上，均勻孵育后生物發(fā)光影像分析儀掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 從圖1中看出，肺癌細(xì)胞使用嗎啡100、200 μg/mL處理6 h和12 h后，抑制活性均在20%以下，隨著時(shí)間延長，抑制效果增加。另外，圖1也顯示嗎啡濃度的增加也能提高對(duì)肺癌A549增殖活力的抑制作用，尤其在48 h濃度為500 μg/mL的嗎啡組能最大程度地提高這種細(xì)胞增殖的抑制效果，達(dá)到41.2%，與100 μg/mL和200 μg/mL嗎啡處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.0128）。如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)的第二階段，我們采用已經(jīng)篩選出的500 μg/mL嗎啡聯(lián)合順鉑30 μg/mL觀察對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖抑制能力，在處理48 h后上機(jī)檢測(cè)，嗎啡聯(lián)合順鉑組對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)77.45%，與單用嗎啡組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.0037），而與單純順鉑作用效果（細(xì)胞增殖抑制率為47.21%）相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0202），提示嗎啡的處理明顯增加順鉑的藥物效力。

圖1 不同濃度嗎啡處理后的肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率

圖2 不同實(shí)驗(yàn)因素處理后肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率

2.2 各組肺癌A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、Survivin等蛋白表達(dá)量 從圖3可見，嗎啡聯(lián)合順鉑組凋亡抑制性蛋白Bcl-2、survivin的表達(dá)明顯下調(diào)，較嗎啡組和對(duì)照組抑制效果明顯，條帶明顯減弱，對(duì)于凋亡促進(jìn)蛋白Bax、Casepase-3等，嗎啡聯(lián)合順鉑組和單獨(dú)使用順鉑組，均能上調(diào)其表達(dá)。

圖3 各組肺癌A549細(xì)胞Bax、Bcl2、Caspase-3、Survivin等蛋白表達(dá)量

3 討論

肺癌目前通過傳統(tǒng)的放化療、手術(shù)切除、中醫(yī)藥以及靶向綜合治療后，有效率和生存率得到大幅度改善[7]，近年患者在綜合治療以及出院后續(xù)治療過程中多伴隨以嗎啡為代表的阿片類輔助藥物的使用。有報(bào)道阿片受體抑制劑可影響肺癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[7-9]，因此科學(xué)合理的選擇阿片類藥物可影響肺癌患者的預(yù)后。

嗎啡作為應(yīng)用廣泛的癌癥鎮(zhèn)痛藥物，研究發(fā)現(xiàn)在腺癌動(dòng)物模型上，可以延緩腫瘤的生長速度，在臨床上也發(fā)現(xiàn)術(shù)前和術(shù)后使用嗎啡可以減少肺癌細(xì)胞擴(kuò)散，其機(jī)制可能是加強(qiáng)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，激活了阿片類受體，抑制了核因子κ，減少了一氧化氮的釋放。最近，嗎啡對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的的影響成為了研究的熱點(diǎn)[10-11]，并在一些細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)，細(xì)胞凋亡作為一種特征性的程序性細(xì)胞死亡模式，與機(jī)體發(fā)育、組織自穩(wěn)定、肺癌、自身免疫疾病和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的自主有序的主動(dòng)死亡過程。其具體機(jī)制包含了一連串能量依賴級(jí)聯(lián)分子事件，受到多種基因調(diào)控。其中凋亡過程中的中樞效應(yīng)器Caspases是內(nèi)外源性凋亡通路的核心，普遍認(rèn)可的Caspase-3是酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，可通過介導(dǎo)或影響其他凋亡抑制蛋白Bcl-2、c-Myc、p53、Rb，以及轉(zhuǎn)化生長因子、核因子κ B通路發(fā)揮其功能作用[12]。Bcl-2蛋白質(zhì)家族是線粒體凋亡通路的主要調(diào)節(jié)因子，包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。Bcl-2和Bcl-xl均可經(jīng)半胱氨酸蛋白酶家族（Caspases）催化裂解。而Bax是受到凋亡信號(hào)刺激后，最早發(fā)生構(gòu)象變化，誘導(dǎo)線粒體膜破裂從而使其功能異常的促凋亡成員。Survivin是發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白家族的新成員，在凋亡發(fā)生中扮演重要角色，能促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，跟增殖期癌細(xì)胞的有絲分裂和對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性機(jī)制有聯(lián)系。因此我們通過檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖調(diào)亡相關(guān)關(guān)鍵靶蛋白表達(dá)量變化來探討嗎啡聯(lián)合使用順鉑的凋亡可能機(jī)制[13-15]。

我們的實(shí)驗(yàn)中，順鉑單獨(dú)應(yīng)用可以抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，激活共同凋亡通路的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)。嗎啡500 μg/mL與順鉑30 μg/mL聯(lián)合處理細(xì)胞后，survivin蛋白和抑制因子Bcl-2的表達(dá)抑制加強(qiáng)，考慮存在輔助增加癌細(xì)胞的殺傷機(jī)制，而單獨(dú)使用嗎啡藥物處理并不能明顯改變凋亡因子的明顯升降，間接說明順鉑誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞凋亡，嗎啡可以在恰當(dāng)?shù)臐舛?，恰?dāng)?shù)臅r(shí)間（本實(shí)驗(yàn)為48 h）協(xié)同增強(qiáng)順鉑的整體促凋亡作用。其中變化最明顯的當(dāng)屬Casepase通路和線粒體凋亡通路的激活表達(dá)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與順鉑早前研究的主要影響線粒體結(jié)構(gòu)和功能引起的異常發(fā)生凋亡有共同的理論基礎(chǔ)，線粒體DNA嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致細(xì)胞能量的不足，從而促進(jìn)內(nèi)源性蛋白酶的釋放，進(jìn)一步活化Caspase-3相關(guān)凋亡途徑，最終導(dǎo)致DNA片段的損失和不可逆修復(fù)。有國外報(bào)道[16]，對(duì)順鉑化療敏感的宮頸癌患者，癌組織蛋白定量顯示Bax蛋白的表達(dá)量與Bcl-2蛋白的表達(dá)比值增加，而在本實(shí)驗(yàn)中嗎啡通過促進(jìn)順鉑作用肺癌細(xì)胞后，Bax/Bcl-2的蛋白灰度比值也是明顯增加，引起細(xì)胞的凋亡活化。

Kuhar等[16]研究從基因水平驗(yàn)證了順鉑作用后Bax的mRNA表達(dá)水平上升，而Bcl-2的mRNA的表達(dá)水平下降，總體趨勢(shì)與本實(shí)驗(yàn)一致。綜上所述，本研究從細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化幾個(gè)方面證實(shí)了嗎啡協(xié)同順鉑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡作用，并初步探討了這一機(jī)制。順鉑能單獨(dú)抑制肺癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡，并且明顯抑制細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、survivin蛋白的表達(dá)，激活Caspase-3，Bax的表達(dá)量顯著增加。嗎啡的聯(lián)合處理明顯增強(qiáng)了了順鉑的抑制增殖和促凋亡功能，與激活內(nèi)源性凋亡途徑和線粒體凋亡途徑有關(guān)。

[1] Dalton JA,Higgins MK,Miller AH,et al.Pain intensity and pain interference in patients with lung cancer:a pilot study of biopsychosocial predictors[J].Am J Clin Oncol,2013 Sep 21.[Epub ahead of print].

[2] Cicero TJ,Shores CN,Paradis AG,et al.Source of drugs for prescription opioid analgesic abusers:a role for the Internet? [J].Pain Med,2008,9(6):718-723.

[3] Liu W,Xie S,Yue L,et al.Investigation and analysis of oncologists’ knowledge of morphine usage in cancer pain treatment[J].Onco Targets Ther,2014,7:729-737.

[4] Wiffen PJ,Derry S,Moore RA.Impact of morphine,fentanyl,oxycodone or codeine on patient consciousness,appetite and thirst when used to treat cancer pain[J].Cochrane Database Syst Rev,2014,5:CD011056.

[5] Liu X,Zhang J,Zhao H,et al.The effect of propofol on intrathecal morphine-induced pruritus and its mechanism[J].Anesth Analg,2014,118(2):303-309.

[6] Li Y,Wang LR,Chen J,et al.First-line gemcitabine plus cisplatin in nonsmall cell lung cancer patients[J].Dis Markers,2014,2014:960458.

[7] Kenmotsu H,Niho S,Ito T,et al.A pilot study of adjuvant chemotherapy with irinotecan and cisplatin for completely resected high-grade pulmonary neuroendocrine carcinoma (large cell neuroendocrine carcinoma and small cell lung cancer)[J].Lung Cancer,2014,84(3):254-258.

[8] Ozturk T,Karadibak K,Catal D,et al.[Comparison of TD-fentanyl with sustained-release morphine in the pain treatment of patients with lung cancer][J].Agri,2008,20(3):20-25.

[9] Komaki R,Paulus R,Ettinger DS,et al.Phase II study of accelerated high-dose radiotherapy with concurrent chemotherapy for patients with limited small-cell lung cancer:Radiation Therapy Oncology Group protocol 0239[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2012,83(4):e531-536.

[10] Hatsukari I,Hitosugi N,Ohno R,et al.Induction of apoptosis by morphine in human tumor cell lines in vitro[J].Anticancer Res,2007,27(2):857-864.

[11] Yin D,Woodruff M,Zhang Y,et al.Morphine promotes Jurkat cell apoptosis through pro-apoptotic FADD/P53 and antiapoptotic PI3K/Akt/NF-kappaB pathways[J].J Neuroimmunol,2006,174(1-2):101-107.

[12] Butkiewicz D,Drosik A,Suwinski R,et al.Influence of DNA repair gene polymorphisms on prognosis in inoperable non-small cell lung cancer patients treated with radiotherapy and platinum-based chemotherapy[J].Int J Cancer,2012,131(7):E1100-E1108.

[13] Shoae-Hassani A,Sharif S,Tabatabaei SA,et al.Could the endogenous opioid,morphine,prevent neural stem cell proliferation?[J].Med Hypotheses,2011,76(2):225-229.

[14] Weber ML,Farooqui M,Nguyen J,et al.Morphine induces mesangial cell proliferation and glomerulopathy via kappa-opioid receptors[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,294(6):F1388- F1397.

[15] 林曉銘,程德志,蔣成榜,等.非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子的聯(lián)合檢測(cè)[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,40(4):405-407.

[16] Kuhar M,Imran S,Singh N.Celecoxib enhances the chemotherapeutic response of cisplatin and TNF-alpha in SiHa cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway[J].Int J Biomed Sci,2007,3(3):176-184.

（本文編輯：吳健敏）

The biological impaction of morphine on lung cancer A549 cells induced by cisplatin

WANG Qiandong1,WU Shujuan2,ZHU Guowen1.
1.Department of Anesthesiology,Ruian People’s Hospital,Wenzhou,325200; 2.Department of Pharmacy,Ruian People’s Hospital,Wenzhou,325200

Objective:To analyze the effect and mechanism of the proliferation inhibition and apoptosis in human lung carcinoma after using morphine combined with cisplatin chemotherapy.Methods:Human lung adenocarcinoma cell line A549 was cultured in conventional 1 640 medium.Cell proliferation activity for cisplatin alone or in combination with morphine after treatment for 6 h,12 h,24 h and 48 h were detected by CCK8.In addition,Western Blot electrophoresis was adopted to detect cisplatin alone or in combination with the optimal concentration of morphine after 48 h.Then changes of apoptosis related proteins Bax,Bcl-2 Caspase-3,survivin expression level were analyzed.Results:After 24 h,or 48 h,the concentration of 500 μg/mL morphine in combination with cisplatin group,compared to morphine and cisplatin alone group,could significantly increase cancer cell proliferation inhibitory effect (P＜0.05).While combined with low-dose concentrations of morphine-treated group,compared with cisplatin alone,the difference was not statistically significant.By WB experiments,we found that the combination of drug treatment could inhibit Bcl-2,survivin protein expression induced by cisplatin,while enhancing the pro-apoptosis death proteins Bax,Caspase-3 expression.Conclusion:The best choice for morphine dosage can significantly enhance proliferation and apoptosis function of cisplatin on lung cancer cell.This may inhibit the proliferation of lung cancer cells by promoting key apoptotic protein Bax and Caspase-3 expression pathway.

morphine; cisplatin; lung cancer; cell biology

R73

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.009

2014-04-15

王錢東（1973-），男，浙江瑞安人，副主任醫(yī)師。