林海霞，蘇震，舒丹樺，何立梅

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

microRNA-494對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控作用

林海霞，蘇震，舒丹樺，何立梅

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

目的：探討microRNA-494（miR-494）對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）刺激后大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK-49F）細(xì)胞外基質(zhì)分泌的調(diào)控作用。方法：體外培養(yǎng)NRK-49F細(xì)胞株，并分為以下6組：TGF-β1（3 ng/mL）組、miR-494模擬物（50 ng/mL）組、miR-494抑制物（50 ng/mL）組、miR-494模擬物（50 ng/mL）+TGF-β1（3 ng/mL）組、miR-494抑制物（50 ng/mL）+TGF-β1（3 ng/mL）組、空白對(duì)照組。莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)細(xì)胞miR-494、膠原蛋白I（Col I）、纖維連接蛋白（FN）mRNA；Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞Col I蛋白。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，TGF-β1組miR-494（P＜0.01）、Col I mRNA（P＜0.05）及FN（P＜0.01）mRNA表達(dá)顯著升高；miR-494模擬物組Col I、FN mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；miR-494抑制物組Col I（P＜0.05）、FN（P＜0.01）mRNA表達(dá)顯著降低。與TGF-β1組比較，miR-494模擬物+TGF-β1組Col I、FN mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；miR-494抑制物+TGF-β1組Col I、FN mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。各組間Col I蛋白與Col I mRNA的表達(dá)水平相一致。結(jié)論：miR-494可能參與調(diào)控并促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)分泌。

腎間質(zhì)纖維化；microRNA-494；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）進(jìn)入終末期腎臟疾病（end-stage renal disease，ESRD）的常見原因之一，其主要分子機(jī)制是腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK-49F）激活成肌成纖維細(xì)胞，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌和沉積。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）β 1被認(rèn)為是促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的重要細(xì)胞因子之一[1]，它可促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的激活并轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞。MicroRNAs（miRNAs，miR-）是一種內(nèi)源性、高保守、長(zhǎng)度約20～25 nt的非蛋白編碼小RNA。目前已發(fā)現(xiàn)1 000多種人類miRNAs，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、分化和疾病相關(guān)的基因[2]。miRNA模擬物是一種化學(xué)合成的雙鏈RNA寡核苷酸化合物，可模擬成熟miRNA結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)成熟miRNA的含量；miRNA抑制物是經(jīng)化學(xué)修飾的單鏈RNA寡核苷酸化合物，可以與細(xì)胞內(nèi)成熟miRNA結(jié)合并形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而顯著減少細(xì)胞內(nèi)成熟miRNA含量。目前，在腎間質(zhì)纖維化的研究中，鮮見miR-494的相關(guān)報(bào)道。本研究通過干預(yù)大鼠NRK-49F細(xì)胞株miR-494的表達(dá)，探討它對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料 胎牛血清（FBS）和DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，人重組TGF-β1購(gòu)自美國(guó)R&D System公司，兔抗大鼠膠原蛋白I（Col I）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，Rea1-time PCR SYBR Green試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司，7300 StepOneTMReal-time PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司，蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：正常大鼠NRK-49F細(xì)胞株（購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)）置于含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1∶3傳代。實(shí)驗(yàn)分6組：空白對(duì)照組、TGF-β 1組、miR-494模擬物組、miR-494模擬物+TGF-β 1組、miR-494抑制物組、miR-494抑制物+TGF-β 1組。miR-494模擬物/抑制物的終濃度均為50 ng/mL。

1.2.2 TGF-β 1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化：待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%融合，用無血清無抗生素DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)16 h后，用濃度為3 ng/mL的TGF-β 1刺激大鼠NRK-49F細(xì)胞24 h，觀察NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)分化情況，空白對(duì)照組不予TGF-β 1刺激。

1.2.3 miR-494模擬物/抑制物（50 ng/mL）轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前1 d進(jìn)行細(xì)胞傳代，待細(xì)胞達(dá)到40%～ 50%融合，將5 μL LipofectminTM2000加入250 μL培養(yǎng)基孵育5 min，同時(shí)將5 μL miR-494模擬物/抑制物加入250 μL培養(yǎng)基孵育5 min，最后將孵育好的LipofectminTM2000與miR-494模擬物/抑制物（1∶1）混勻后靜置20 min，將上述500 μL混合液加入含有1.5 mL培養(yǎng)基的細(xì)胞中。6 h后，大鼠NRK-49F細(xì)胞更換含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 miR-494模擬物/抑制物與TGF-β 1共同作用于NRK-49F細(xì)胞：先使用miR-494模擬物/抑制物轉(zhuǎn)染NRK-49F細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，對(duì)其進(jìn)行饑餓16 h，加入3 ng/mL TGF-β 1刺激24 h，并收集各組細(xì)胞。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)NRK-49F細(xì)胞miR-494、Col I mRNA、纖維連接蛋白（FN）mRNA：采用Trizol一步法抽提總RNA。取1 μL RNA溶液，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)波長(zhǎng)260 nm和280 nm的光密度（OD）值，計(jì)算RNA的濃度。cDNA反應(yīng)條件：72 ℃ 10 min預(yù)變性，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存。以cDNA為模板，采用Real-time PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 2 min，變性95 ℃30 s，退火60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。至少重復(fù)3次。

采用7300 StepOneTMReal-time PCR系統(tǒng)軟件分析，miR-494和Col I、FN mRNA的相對(duì)含量用公式Folds=2-ΔΔCT表示，U6、GAPDH分別作為miR-494和mRNA的內(nèi)參基因。其中Δ ΔCT=（CT1-CT2）-（CT3-CT4），CT1為處理組樣品待測(cè)基因的CT值，CT2為處理組樣品內(nèi)參基因的CT值，CT3為對(duì)照組樣品待測(cè)基因的CT值，CT4為對(duì)照組樣品內(nèi)參基因的CT值。各引物序列見表1-2。

表1 特異性反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物序列

表2 特異性RT-PCR引物序列

1.2.6 Western Blot法檢測(cè)NRK-49F細(xì)胞Col I蛋白：提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰氨凝膠（SDS-PAGE）分離蛋白并轉(zhuǎn)到PVDF膜（0.45 μm）上。孵育Col I抗體1∶500和β-actin抗體1∶500，4 ℃過夜，洗膜，再與相應(yīng)的二抗孵育1 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，凝膠成像系統(tǒng)曝光，Photoshop CS5圖像分析軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，以βactin為內(nèi)參對(duì)照，蛋白表達(dá)強(qiáng)度以各組光密度與βactin光密度的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，兩組間計(jì)量資料采用成組t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β 1刺激NRK-49F細(xì)胞后miR-494、Col I mRNA、FN mRNA表達(dá) TGF-β 1（3 ng/mL）刺激NRK-49F細(xì)胞后，Real-time PCR結(jié)果示：與空白對(duì)照組比較，TGF-β 1組Col I mRNA、FN mRNA以及miR-494表達(dá)均明顯上升（P＜0.01或P＜0.05），見表3。

表3 TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞后miR-494、Col I mRNA、FN mRNA表達(dá)變化（n=3，）

表3 TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞后miR-494、Col I mRNA、FN mRNA表達(dá)變化（n=3，）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

2.2 miR-494模擬物/抑制物單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與TGF-β 1共同作用于NRK-49F細(xì)胞后Col I、FN mRNA的表達(dá)

Real-time qPCR分析示：與空白對(duì)照組比較，miR-494模擬物組Col I、FN mRNA表達(dá)明顯上升（均P＜0.05）；miR-494抑制物組Col I、FN mRNA表達(dá)明顯下降（均P＜0.01）。與TGF-β 1組比較，miR-494模擬物+TGF-β 1組Col I、FN mRNA表達(dá)顯著上升（均P＜0.05）；miR-494抑制物+TGF-β 1組Col I、FN mRNA表達(dá)顯著下降（均P＜0.05）。見表4。

2.3 miR-494模擬物/抑制物單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與TGF-β 1共同作用于NRK-49F細(xì)胞后Col I蛋白的表達(dá) Western Blot法檢測(cè)結(jié)果示：Col I蛋白的表達(dá)變化與其mRNA表達(dá)基本一致。與空白對(duì)照組比較，miR-494模擬物組和miR-494模擬物+TGF-β 1組Col I蛋白表達(dá)均明顯上升（均P＜0.05）；而與TGF-β 1組比較，miR-494抑制物+TGF-β 1組Col I蛋白顯著下降（P＜0.05）。見圖1、表5-6。

表4 NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-494模擬物/抑制物與TGF-β 1共同作用后Col I、FN mRNA的表達(dá)變化（n=3，）

表4 NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-494模擬物/抑制物與TGF-β 1共同作用后Col I、FN mRNA的表達(dá)變化（n=3，）

與空白對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與TGF-β1組比：cP＜0.05

圖1 miR-494模擬物/抑制物與TGF-β1共同作用于NRK-49F細(xì)胞后Col I蛋白表達(dá)

表5 NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-494模擬物與TGF-β1共同作用后Col I蛋白表達(dá)（n=3）

表5 NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-494模擬物與TGF-β1共同作用后Col I蛋白表達(dá)（n=3）

與空白對(duì)照組比：aP＜0.05

表6 NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-494抑制物與TGF-β1共同作用后Col I蛋白表達(dá)（n=3）

表6 NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-494抑制物與TGF-β1共同作用后Col I蛋白表達(dá)（n=3）

與空白對(duì)照組比：aP＜0.05；與TGF-β1組比：bP＜0.05

3 討論

腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞[3]。腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制主要涉及細(xì)胞因子異常表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積、細(xì)胞異常增殖和分化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等[4]。腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的異常積聚在腎間質(zhì)纖維化的過程中發(fā)揮了重要作用。

近年來的研究表明miRNAs在多種疾病中起重要作用，并且參與一些常見腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。目前已發(fā)現(xiàn)miR-132[6]、miR-21[7]、miR-200b[8]和miR-29[9]等在腎間質(zhì)纖維化中出現(xiàn)差異性表達(dá)。Megiorni等[10]認(rèn)為miR-101/miR-494的結(jié)合可以顯著抑制囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)器（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）的活性。我們前期研究采用高通量（Solexa）測(cè)序技術(shù)和莖環(huán)RT-qPCR法檢測(cè)大鼠單側(cè)輸尿管梗阻腎間質(zhì)纖維化模型（unilateral ureteral obstruction，UUO）和5/6腎切除大鼠模型，發(fā)現(xiàn)腎臟纖維化組織中miR-494出現(xiàn)差異性表達(dá)（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。

在慢性腎臟疾病中，TGF-β 1已被證實(shí)參與腎臟纖維化的進(jìn)展[11]。我們采用TGF-β 1刺激大鼠NRK-49F細(xì)胞，使之轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞。最近研究發(fā)現(xiàn)，人支氣管上皮細(xì)胞暴露于抗-苯并[α]芘，反式-1，8-二醇-9，10-環(huán)氧化物的實(shí)驗(yàn)中，miR-494的表達(dá)上調(diào)可以引起同源性磷酸酶（phosphatase and tensin homolog，PTEN）下降[12]。PTEN是蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）激活抑制劑，而TGF-β 1可以激活PKB[13]。體內(nèi)/體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制PTEN的表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致腎臟纖維化[13-14]、皮膚纖維化[15]、心臟纖維化[16]、肺纖維化[17]、肝臟纖維化[18]及口腔黏膜纖維化[19]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2滅活后，miR-494表達(dá)下調(diào)[20]，激活ERK1/2可以促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生[21]。從上述研究結(jié)果可以推測(cè)出TGF-β 1是miR-494上調(diào)因素之一，此外，在髓源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）中，TGF-β1被認(rèn)為是miR-494上調(diào)的主要因素[22]。并且本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β 1可誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞中miR-494表達(dá)，miR-494模擬物與TGF-β 1共同作用可以增加TGF-β 1誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（Col I、FN）的表達(dá)；反之，miR-494抑制物與TGF-β 1共同作用可以抑制TGF-β 1誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（Col I、FN）的表達(dá)?？梢姡琺iR-494可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，是腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展過程的一個(gè)促進(jìn)因子。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-494可進(jìn)一步促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠NRK-49F細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，因此檢測(cè)miR-494的表達(dá)可為腎間質(zhì)纖維化提供一種新的診斷方法，而抑制miR-494的表達(dá)可為延緩腎間質(zhì)纖維化提供新的治療靶點(diǎn)。結(jié)合課題組前期研究結(jié)果（在UUO大鼠模型和5/6腎切除大鼠模型的腎組織中miR-494出現(xiàn)差異表達(dá)），我們推測(cè)，在體內(nèi)miR-494和細(xì)胞外機(jī)制之間存在重要調(diào)控關(guān)系，但有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Adjusting and controlling effect of microRNA-494 on extracellular matrix of secretion cells in renal inter-stitial fibroblast

LIN Haixia, SU Zhen, SHU Danhua, HE Limei.
Department of Nephrology, the First Affili-ated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore the adjusting and controlling effect of microRNA-494 (miR-494) on extracellular matrix of the secretion cells in renal interstitial fbroblast (NRK-49F) cells after stimulation of TGF-β1. Methods: NRK-49F cells were cultured in vitro and divided into: TGF-β1 (3 ng/mL) group, miR-494 mimics (50 ng/mL) group, miR-494 inhibitor (50 ng/mL) group, co-treated with miR-494 mimics (50 ng/mL) and TGF-β1 (3 ng/mL) group, co-treated with miR-494 inhibitor (50 ng/mL) and TGF-β1 (3 ng/mL) group, blank control group. The expression of miR-494, collagen I (Col I), fbronectin (FN) mRNAs were analyzed by stem-loop real-time quantitative PCR (RT-qPCR) techniques. The expression of Col I protein was analyzed by Western Blot. Results: Compare with blank control group, the expression of miR-494 (P＜0.01), Col I (P＜0.05) and FN (P＜0.01) mRNA were signifcantly increased in TGF-β1 group, the expression of Col I and FN mRNA were signifcantly increased in miR-494 mimics group (P＜0.05), the expression of Col I (P＜0.05) and FN (P＜0.01) mRNAs were signifcantly decreased in miR-494 inhibitor group. Compared with TGF-β1 group, the expression of Col I and FN mRNAs were signifcantly increased in co-treated with miR-494 mimics and TGF-β1 group (P＜0.05), the expression of Col I and FN mRNA were signifcantly decreased in co-treated with miR-494 inhibitor and TGF-β1 group (P＜0.05), the expression of Col I protein was consistent with Col I mRNA (P＜0.05). Conclusion: miR-494 can promote the TGF-β1 inducing secretion and deposition of extracellular matrix.

renal interstitial fbrosis; microRNA-494; transforming growth factor-β1

R572

ADOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.002

2014-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30871179/c140405）；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目（浙衛(wèi)發(fā)[2010]190號(hào)文件）；浙江省錢江人才計(jì)劃項(xiàng)目（2011R1083）。

林海霞（1988-），女，浙江蒼南人，碩士生。

蘇震，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：drzhensu @hotmail.com。