張躍進(jìn)，柳獻(xiàn)云，陳向敏，田曉娟，李文姝，薛向陽(yáng)

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中藥房，浙江 溫州325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，浙江 溫州 325035；4.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與疫苗研究所、微生物與免疫學(xué)教研室，浙江 溫州 325035）

·論 著·

HCMV-UL138 CTL表位肽重組酵母菌的構(gòu)建及其免疫效應(yīng)

張躍進(jìn)1，柳獻(xiàn)云2，陳向敏3，田曉娟4，李文姝4，薛向陽(yáng)4

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中藥房，浙江 溫州325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，浙江 溫州 325035；4.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與疫苗研究所、微生物與免疫學(xué)教研室，浙江 溫州 325035）

目的：以乙肝病毒表面抗原為載體，制備含人巨細(xì)胞病毒（HCMV）-UL138 CTL表位肽的重組酵母菌并分析其免疫效應(yīng)。方法：根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得HCMV-UL138氨基酸序列，綜合應(yīng)用SYFPEITHI、Net-CTL及HLA-Bind方法篩選富含CTL表位的UL138多肽，插入到乙肝表面抗原前S2（PreS2）1-9區(qū)末端再與HBsAg序列連接，在不改變氨基酸密碼的前提下，根據(jù)酵母偏愛(ài)密碼子優(yōu)化序列，進(jìn)行全序列合成，克隆入pPIC3.5K酵母載體，構(gòu)建pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)Bgl Ⅱ處理線性化后，電轉(zhuǎn)化至GS115菌株中，構(gòu)建PreS2-HBsAg-UL13815-27重組酵母，陽(yáng)性整合菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，通過(guò)Western blot及ELISA方法鑒定目的蛋白表達(dá)。鑒定的重組酵母菌經(jīng)滅活后，全菌體皮下免疫BALB/c小鼠，通過(guò)ELISA法檢測(cè)HBsAg特異性血清IgG抗體；UL13815-27CTL表位肽（VMLVLIVAILCYL）刺激免疫小鼠的脾細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)IFN-γ表達(dá)分析誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL反應(yīng)。結(jié)果：PCR、酶切和測(cè)序分析表明成功構(gòu)建了pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質(zhì)粒。重組酵母經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，酵母裂解液中可檢測(cè)到HBsAg特異性抗體識(shí)別的、分子量約33 kD目的蛋白。表達(dá)PreS2-HBsAg-UL13815-27滅活全菌體免疫小鼠后，可檢測(cè)到HBsAg特異性抗體，免疫小鼠脾細(xì)胞經(jīng)UL13815-27CTL表位肽刺激，IFN-γ表達(dá)水平比對(duì)照組明顯升高。結(jié)論：重組酵母全菌體成功表達(dá)了PreS2-HBsAg-UL13815-27重組蛋白，且重組酵母菌全菌體免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生UL13815-27特異性的細(xì)胞免疫。

人類(lèi)巨細(xì)胞病毒；CTL表位；乙肝病毒表面抗原；重組酵母

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是人群普遍感染的一種皰疹病毒。它可引起新生兒宮內(nèi)感染或圍生期感染，造成流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、發(fā)育遲緩、聽(tīng)力障礙、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩等，是人類(lèi)先天性病毒感染的最常見(jiàn)病原體[1]。另外，HCMV的后天感染或潛伏病毒再激活還可嚴(yán)重威脅組織器官移植個(gè)體和艾滋病患者的生命[2-3]。盡管一些有效抑制病毒復(fù)制的藥物（如更昔洛偉等）已廣泛用于HCMV的預(yù)防和治療，但因不良反應(yīng)（如骨髓抑制、腎毒性等）大、出現(xiàn)耐藥性及存在孕婦這一特殊人群，故尋求有效的疫苗仍是防治HCMV感染的主要途徑。目前在研的HCMV疫苗，雖有一定的免疫效果，但仍然存在免疫原性弱和不能清除細(xì)胞內(nèi)潛伏HCMV感染等問(wèn)題[4-5]。

細(xì)胞免疫，尤其是CTL反應(yīng)是宿主抗胞內(nèi)病原免疫的主要途徑。另外，采用基因工程方法在酵母細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）已被證實(shí)為較好的抗原攜帶和釋放系統(tǒng)[6-11]。本研究擬選擇不同HCMV株間高度保守的潛伏相關(guān)膜抗原（UL138），利用生物信息學(xué)篩選富含CTL表位的肽段，同時(shí)對(duì)HBsAg進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過(guò)基因克隆技術(shù)構(gòu)建表達(dá)UL138多表位-HBsAg的重組酵母，并分析其刺激小鼠產(chǎn)生的免疫效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料 ①菌株及載體：酵母表達(dá)載體pPIC3.5K、E.coli.DH5α菌株、GS115畢赤酵母菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。②工具酶及其他試劑：限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、EcoR I、Bgl Ⅱ、T4 DNA連接酶、核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker、蛋白預(yù)染Marker、2×PCR Master Mix均購(gòu)自Ferments公司；DEPC處理水購(gòu)自TaKaRa公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；RPMI-1640培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自life technologies公司；小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司；HBsAg診斷試劑盒及乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自溫州金葉試劑公司，并按說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)HBsAg特異性IgG抗體；其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。UL13815-27CTL表位肽（VMLVLIVAILCYL）由上海生物工程有限公司合成。Rever Tra Ace反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、SYBR Mastermix定量PCR試劑購(gòu)自日本Toyobo公司。③實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性BALB/c小鼠6～8周齡均購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 HCMV-UL138富含CTL抗原表位多肽的篩選：自NCBI網(wǎng)站的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得HCMV UL138基因全序列，應(yīng)用SYFPEITHI服務(wù)器（http∶//www.syfpeithi.com/）上的EPITOPE PREDICTION方法、Net-CTL服務(wù)器（http∶//www.cbs.dtu.dk/services/ NetCTL/）及HLA-Bind預(yù)測(cè)受HLA-A2限制的CTL表位。綜合SYFPEITHI、Net-CTL及HLA-Bind方法篩選富含CTL表位的UL138多肽，見(jiàn)表1和圖1。

1.2.2 重組質(zhì)粒pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27的設(shè)計(jì)及構(gòu)建：考慮到UL138 CTL表位肽插入會(huì)影響HBsAg病毒樣顆粒（VLP）的形成，本研究根據(jù)吳光華等[12]報(bào)道的中國(guó)地區(qū)C型HBV基因組參照序列（CHN-HBV07-C），選擇編碼PreS21-9（MQWNSTTLN）及HBsAg的基因序列，將編碼篩選的富含CTL表位的HMV-UL3815-27（VMLVLIVAILCYL）的基因插入到PreS21-9羧基端再與HBsAg基因序列連接，根據(jù)酵母偏愛(ài)密碼子優(yōu)化基因序列。合成目的基因經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切處理后與pPIC3.5K載體連接獲得pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質(zhì)粒，見(jiàn)圖2A。以通用引物5’AOX和3’AOX行PCR鑒定，挑取陽(yáng)性克隆送測(cè)序，結(jié)果正確的克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 PreS2-HBsAg-UL13815-27重組酵母菌的制備及目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒，Bgl Ⅱ酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞。采用組氨酸缺陷的MD平板篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)一步行PCR鑒定，篩選PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母菌。按照《畢赤酵母手冊(cè)》步驟操作，將保存于-80 ℃的菌株活化兩次后接種于BMGY培養(yǎng)基中，置全溫震蕩培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)至OD600=5～6，離心后收集菌體。將菌體細(xì)胞重懸于BMMY培養(yǎng)基中，振蕩誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24 h補(bǔ)加誘導(dǎo)體積1%的甲醇，誘導(dǎo)結(jié)束后，收集的酵母沉淀，PBS緩沖液洗滌后，用低溫超高壓連續(xù)流破碎細(xì)胞，破碎機(jī)在1 500～1 800 bar，4～6 ℃條件下進(jìn)行破碎，重復(fù)處理3次，高速離心獲得蛋白。

1.2.4 Western blot和ELISA法鑒定目的蛋白表達(dá)：將酵母細(xì)胞上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，以1∶3 000的小鼠抗HBsAg單克隆抗體（購(gòu)自abcam公司）為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠（1∶6 000）為二抗（購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），利用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒（天根生化公司）顯色，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。目的蛋白均在HBsAg基礎(chǔ)上構(gòu)建，為此采用HBsAg診斷試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)酵母細(xì)胞上清液中HBsAg，進(jìn)一步驗(yàn)證目的蛋白表達(dá)。

1.2.5 小鼠免疫方法：雌性BALB/c近交系小鼠6～8周齡32只，隨機(jī)分為4組，分別為表達(dá)PreS2-HBsAg-UL13815-27目的蛋白的重組畢赤酵母菌組（I組）、轉(zhuǎn)化pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌組（Ⅱ組）、GS115酵母菌組（Ⅲ組）以及UL13815-27表位肽聯(lián)合免疫轉(zhuǎn)化pPIC3.5K的GS115酵母菌組（IV組），每組8只。表達(dá)目的蛋白的重組畢赤酵母菌、轉(zhuǎn)化pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌及GS115空菌對(duì)照，60 ℃滅活1 h，背部皮下多點(diǎn)注射免疫小鼠，每2周免疫1次，共3次，每次每只小鼠免疫5YU酵母（1YU相當(dāng)于1×107個(gè)酵母細(xì)胞），其中IV組小鼠的免疫是將5 μ g化學(xué)合成的UL13815-27表位肽與轉(zhuǎn)化pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌混合后進(jìn)行皮下免疫。每次免疫前斷尾取血，收集血清保存于-20 ℃。

1.2.6 熒光定量RT-PCR檢測(cè)UL13815-27表位肽細(xì)胞免疫反應(yīng)：流式細(xì)胞術(shù)、ELISPOT或ELISA法檢測(cè)IFN-γ是評(píng)價(jià)CTL反應(yīng)的經(jīng)典方法，由于瞬時(shí)表達(dá)是細(xì)胞因子的重要特征，許多研究也采用mRNA水平衡量IFN-γ的表達(dá)[13-15]。①小鼠脾細(xì)胞懸液制備：取小鼠脾臟置于含8 mL Hank’s液的平皿，以200目篩網(wǎng)研磨壓出脾細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，以Hank’s液洗二次，用2 mL含10%小牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度5×105/mL。②脾細(xì)胞刺激：每只小鼠脾細(xì)胞懸液取0.4 mL（約5×105/mL）置于24孔培養(yǎng)板中，加入含10 μ g/mL UL13815-27CTL表位肽（VMLVLIVAILCYL）RPMI-1640培養(yǎng)液0.4 mL，使表位肽終濃度為5 μ g/mL。以5 μ g/mL ConA為陽(yáng)性對(duì)照，未做刺激的小鼠脾細(xì)胞懸液為陰性對(duì)照。加樣完后將24孔培養(yǎng)板置于含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，收集細(xì)胞，加300 μ L Trizol提取RNA。③RNA提?。喊碩rizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取，以15 μ L的DEPC處理水溶解RNA，置于-80 ℃冰箱保存。④RTPCR檢測(cè)：在PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總RNA與oligo dT混合后，70 ℃ 10 min，立即置冰上，后加其他成分，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物用雙蒸水稀釋5倍，并于-20 ℃保存。95 ℃2 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 1 min退火延伸，40個(gè)循環(huán)，所有樣品做3復(fù)孔。記錄各樣本熒光動(dòng)力曲線圖和熔解曲線圖，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，采用定量PCR中的相對(duì)定量法，IFN-γ相對(duì)表達(dá)量（N）=2△△Ct，其中△△Ct=[實(shí)驗(yàn)組（CtIFN-γ-CtGAPOH）-對(duì)照組（CtIFN-γ-CtGAPOH）]，由此推導(dǎo)得出目的基因的相對(duì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2組獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，3組及以上獨(dú)立樣本組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCMV潛伏相關(guān)抗原UL138富含CTL表位肽的篩選 SYFPEITHI、Net-CTL及HLA-Bind預(yù)測(cè)顯示，3種方法均高評(píng)分的HLA-A*02限制的CTL表位肽為UL13815-23（VMLVLIVAI）、UL13816-24（MLVLIVAIL）、UL13819-27（LIVAILCYL）及UL138154-162（TQFTTVAMV），提示UL13815-23肽段富含HLA-A*02限制的CTL表位。除外HLA-A*02限制的CTL表位，該肽段還含多個(gè)高評(píng)分的HLA-A*03、26，HLA-A*B08及H2-Kd限制的CTL表位，見(jiàn)表1和圖1。

2.2 pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組表達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)及質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖2A。PCR鑒定可擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符合的大小約774 bp的片段，重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切同樣顯示PreS2-HBsAg-UL13815-27基因已成功插入pPIC3.5K載體中，DNA測(cè)序結(jié)果顯示插入片段序列與設(shè)計(jì)的序列完全符合，見(jiàn)圖2B。

圖1 UL138富含CTL表位肽段

表1 UL138抗原HLA-A*02限制CTL表位3種方法預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)和酶切鑒定結(jié)果

2.3 PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物鑒定 將已構(gòu)建并鑒定的重組酵母進(jìn)行培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)其表達(dá)目的蛋白，含目的基因HBsAg-UL13815-27的畢赤酵母菌裂解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用HBsAg單克隆抗體進(jìn)行Western blot法分析，可檢測(cè)到分子量約為33 kD的目的條帶，見(jiàn)圖3。用HBsAg診斷試劑盒檢測(cè)重組酵母菌菌體裂解產(chǎn)物，與空菌和空載體組比較，含目的基因的重組酵母菌菌體裂解產(chǎn)物中能檢測(cè)到HBsAg的存在，見(jiàn)圖4。

2.4 PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母免疫效應(yīng)分析

2.4.1 HBsAg特異性抗體檢測(cè)：表達(dá)PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母、轉(zhuǎn)化pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌及GS115空菌滅活后背部皮下多點(diǎn)免疫BALB/c小鼠；UL13815-27表位肽和pPIC3.5K空載體的GS115酵母菌混合后皮下免疫BALB/c小鼠；ELISA試劑盒檢測(cè)4組免疫血清中HBsAg特異性IgG抗體水平。與Ⅱ組、Ⅲ組、IV組比較，表達(dá)PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母加強(qiáng)免疫后，血清HBsAg特異性IgG抗體水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖3 PreS2-HBsAg-UL13815-27蛋白的SDS-PAGE和Western blot法分析

圖4 ELISA法檢測(cè)重組酵母產(chǎn)物中HBsAg表達(dá)水平

2.4.2 細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)：用合成的UL13815-27表位肽（VMLVLIVAILCYL）刺激免疫小鼠脾細(xì)胞，檢測(cè)PreS2-HBsAg-UL13815-27重組畢赤酵母免疫誘導(dǎo)的、針對(duì)UL138 CTL表位肽產(chǎn)生的細(xì)胞免疫效應(yīng)，經(jīng)定量PCR檢測(cè)IFN-γ表達(dá)水平。表達(dá)PreS2-HBsAg-UL13815-27目的蛋白的重組畢赤酵母免疫小鼠脾細(xì)胞IFN-γ水平明顯升高，而且比UL13815-27表位肽聯(lián)合免疫轉(zhuǎn)化pPIC3.5K的GS115酵母菌組小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

3 討論

圖5 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中HBsAg特異性抗體IgG水平

圖6 UL13815-27表位肽刺激脾細(xì)胞后IFN-γ水平

HCMV疫苗的研究開(kāi)始于減毒活疫苗，已經(jīng)研究的AD169和Towne毒株的減毒疫苗僅能產(chǎn)生有限的免疫保護(hù)作用，且病毒具有回復(fù)突變的可能和潛在的致癌性，近年來(lái)HCMV疫苗的研究主要基于候選靶抗原的基因工程疫苗[16-18]。其中糖蛋白gB（UL55基因產(chǎn)物）和病毒包膜磷蛋白pp65（UL83基因產(chǎn)物）是最為重要的候選疫苗抗原[16-18]，但動(dòng)物和臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其存在免疫原性弱、免疫范圍局限等缺點(diǎn)[16-18]。HCMV潛伏相關(guān)膜蛋白UL138首次由Goodrum等[19-20]通過(guò)芯片分析發(fā)現(xiàn)。同源性分析表明，在不同HCMV臨床分離株、實(shí)驗(yàn)室株間的UL138核酸及蛋白質(zhì)序列保守性高于97%[21]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HCMV潛伏感染的正常人群存在針對(duì)UL138的CD4+和CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)[22]；除外在潛伏期相對(duì)特異表達(dá)，UL138的表達(dá)可持續(xù)到HCMV裂解期[23]。這些研究提示UL138也是重要的HCMV疫苗候選抗原，誘導(dǎo)針對(duì)UL138的免疫反應(yīng)除殺傷潛伏狀態(tài)的HCMV感染細(xì)胞外還可抑制HCMV活化增殖。

近年來(lái)以特異性表位為基礎(chǔ)表位疫苗是目前疫苗研究的熱點(diǎn)，它既能誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答，又避免了天然抗原中對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響的成分，但表位疫苗的免疫原性弱尚待解決。研究表明，采用基因工程方法在酵母細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的HBsAg已被證明是極佳的抗原攜帶和釋放系統(tǒng)[6-11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，以HBsAg VLP為載體，用外源性CTL表位取代HBsAg的CTL表位，可明顯增強(qiáng)外源性表位的免疫原性[24]。在完整的HBV病毒體中，前S1（PreS1）和前S2（PreS2）與HBsAg共同組成HBV的包膜。在PreS2與HBsAg間插入外源抗原肽，理論上也能維持HBsAg VLP的構(gòu)象。有研究已證明在PreS2的第7與第8個(gè)氨基酸的密碼子之間插入了人單純皰疹病毒的一段編碼300個(gè)氨基酸的核酸序列，并于酵母系統(tǒng)中表達(dá)，電鏡觀察到25～31 nm的病毒樣顆粒，表明插入的基因序列沒(méi)有干擾HBsAg顆粒的自我組裝[25]。因此本研究在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)基礎(chǔ)上，選擇富含CTL表位的UL13815-27肽段，插入到PreS21-9區(qū)末端，再與HBsAg序列連接，構(gòu)建表達(dá)PreS2-HBsAg-UL13815-27重組酵母。SDS-PAGE電泳、Western blot及ELISA法均證實(shí)目的蛋白的表達(dá)。

有研究發(fā)現(xiàn)，人腸道病毒71型（EV71）VP1基因作為一種含N-末端組氨酸的分泌蛋白，可在畢赤酵母菌中被表達(dá)；重組VP1在BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗Vp1抗體，在體外中和試驗(yàn)中能有效地中和EV71病毒。其酵母表達(dá)的VP1蛋白保留了良好的免疫原性，可誘導(dǎo)分泌Th1型細(xì)胞因子[26]。此外，口蹄疫病毒VP1和合成多表位口蹄疫病毒（EG）與HSP70融合，均能在畢赤酵母中表達(dá)，并作為抗原免疫小鼠，EGHSP70可誘導(dǎo)分泌更高水平的IFN-γ和IL-4[27]，提示重組酵母可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)靶基因的特異性反應(yīng)。其中酵母細(xì)胞壁中多糖作為一種良好的天然佐劑，能促進(jìn)淋巴細(xì)胞IFN-γ、IL-2和IL-4等細(xì)胞因子分泌，對(duì)于細(xì)胞免疫應(yīng)答及體液免疫應(yīng)答均有顯著的促進(jìn)作用[28-29]。其他研究還發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體后，可有效地被DC細(xì)胞吞噬，并促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟分化[30]。另外，考慮到采用酵母全菌體作為疫苗，減少了目的蛋白的純化步驟，因此成本更加低廉。為此，本研究滅活酵母全菌體免疫小鼠，評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示表達(dá)PreS2-HBsAg-UL13815-27目的蛋白的重組畢赤酵母免疫后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生HBsAg特異的IgG，以及針對(duì)UL138 CTL表位肽產(chǎn)生的細(xì)胞免疫。而且，與UL13815-27表位肽聯(lián)合滅活酵母菌免疫小鼠相比，表達(dá)含HBsAg的重組畢赤酵母菌免疫小鼠產(chǎn)生的IFN-γ水平更高，提示在酵母多糖佐劑效應(yīng)基礎(chǔ)上，HBsAg載體可進(jìn)一步增強(qiáng)外源性表位的免疫原性。

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（本文編輯：吳彬）

Construction and immune response of recombinant whole-cell yeast expressing HCMV-UL138 CTL epit-ope

ZHANG Yuejin1, LIU Xianyun2, CHEN Xiangmin3, TIAN Xiaojuan4, LI Wenshu4, XUE Xiangyang4. 1.School of Nursing, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Pharmacy of Traditional Chinese Medicine, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 3.Biological Laboratory Education Center, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 4.Institute of Molecular Virology and Immunology, Department of Microbiology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To construct the recombinant yeast expressing HCMV-UL138 CTL epitope based on the carrier of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), and further explore its immune response. Methods: The complete amino acid sequence of HCMV UL138 was retrieved from the SwissProt Database. The CTL epitopesriched peptide screened by the methods of SYFPEITHI, Net-CTL and HLA-Bind were inserted into the C-terminal of PreS21-9 sequence, then linked to the N-terminal of HBsAg sequence. The aim sequence optimized according to the yeast cell codon preference was synthesized and cloned into pPIC3.5K vector of yeast expression. The constructed pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27recombinant plasmid was linearized by Bgl II restriction enzyme and electricity transformed into GS115 strain to construct PreS2-HBsAg-UL13815-27recombinant yeast. Identified recombinant strains were then induced by methanol. The expression of aim protein was identified by Western Blot and ELISA methods using HBsAg antibodies. The identified recombinant yeast cells wereinactivated by heat and vaccinated mice by subcutaneous injection. Specific antibodies to HBsAg were detected by ELISA, and cytotoxic T lymphocyte (CTL) response were detected by investigating the interferon-γ (IFN-γ) expression by RT-PCR when immune spleen cells of mice were stimulated by UL13815-27CTL epitope peptide (VMLVLIVAILCYL). Results: Data of PCR detection, restriction enzyme digestion and sequencing analysis showed that pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27recombinant plasmid was successfully constructed. After induced by the methanol, HBsAg-specific antibodies confirmed the expression of PreS2-HBsAg-UL13815-27with molecular weight about 33 kD in the lysate of the recombinant yeast. The immunization of inactivated recombinant whole-cell yeast expressing PreS2-HBsAg-UL13815-27could induce significantly anti-HBsAg-specific IgG antibodies. When the immune spleen cells of mice were stimulated by UL13815-27CTL epitope peptide, analysis of cellular immune revealed that the production of IFN-γ significantly increased in the group of inactivated recombinant whole-cell yeast expressing PreS2-HBsAg-UL13815-27than that in the control groups. Conclusion: The recombinant Pichia pastoris yeast expressing PreS2-HBsAg-UL13815-27protein is successfully constructed. The specific UL138-specific cellular immune response can be induced in the immunized mice with recombinant whole yeast cells.

human cytomegalovirus (HCMV); CTL epitope; HBV surface antigen (HBsAg); recombinant yeast

Q939.91

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.004

2015-02-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81001343、81472308）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2100909）；溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20120159）。

張躍進(jìn)（1960-），女，浙江溫州人，實(shí)驗(yàn)師。

薛向陽(yáng)，副教授，Email：wzxxy001@163.com。