曹珂珂，李 妍

（蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

利用葡萄渣黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究

曹珂珂，李 妍

（蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

對黑曲霉（Aspergillus niger）BB-6利用葡萄渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的發(fā)酵條件進行研究。結(jié)果表明，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖4%、硫酸銨0.6%，含水量60%，培養(yǎng)溫度30℃條件下培養(yǎng)72 h，果膠酶酶活達12.226 U/g。

果膠酶；葡萄渣；黑曲霉；固態(tài)發(fā)酵

Key worlds:pectinase;grape pomace;Aspergillus niger;solid state fermentation

果膠酶（pectinase）是分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱，主要包括原果膠酶（protopectinase，PPase）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠裂解酶（pectate lyases，PL）和果膠酯酶（pectin esterase，PE）[1-3]。果膠酶是世界上四大酶制劑之一，主要應用于果汁澄清、果蔬汁提取、果實脫皮、木材防腐、麻類脫膠、棉織物精煉加工等行業(yè)[4-6]。果膠酶來源于植物和微生物，目前商品果膠酶主要來源于微生物所產(chǎn)的果膠酶。細菌、放線菌、霉菌和酵母菌都能產(chǎn)生果膠酶[7-9]，黑曲霉（Aspergillus niger）是公認的安全級微生物，其代謝產(chǎn)物果膠酶也是安全的。

葡萄渣是釀酒過程中的下腳料，包括葡萄籽和葡萄皮，其含有粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、多種微量元素和果膠等[10-11]。葡萄渣一般都是直接作為飼料，其所產(chǎn)生的經(jīng)濟價值相對較低，通過固態(tài)發(fā)酵能提升葡萄渣的潛在價值。目前利用葡萄渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究還比較少，因此本實驗采用黑曲霉（Aspergillus niger）BB-6作為產(chǎn)酶菌株，利用葡萄渣和麩皮固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶，為提高葡萄渣的產(chǎn)品附加值開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（A.niger）BB-6由蚌埠學院生物與食品工程系微生物實驗室保存；葡萄渣為鮮葡萄榨汁后，果渣烘干、粉碎、過篩。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸汁（20%）100 m L，葡萄糖2 g，瓊脂1.5～2 g，pH自然。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮10 g，水60%，pH自然。

半乳糖醛酸（分析純）：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑、葡萄糖、硫酸銨等均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；果膠：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

752N紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；BHC生物潔凈安全柜：蘇州凈化設備有限公司；LRH微電腦控制生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；KDC高速冷凍離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；BSD立式智能精密搖床：上海恒訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 果膠酶活力檢測

采用3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）[12]。酶活定義：在50℃、pH 5.0的條件下，1 h分解果膠產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位（U/g）。

1.3.2 葡萄渣與麩皮的添加比例

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄渣，使葡萄渣與麩皮分別按不同質(zhì)量比0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0混合均勻。滅菌后接入1 m L孢子懸液（含黑曲霉孢子107CFU/m L），30℃培養(yǎng)72 h，每隔24 h扣瓶一次，確定葡萄渣與麩皮的最佳比例。固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，在三角瓶中加入料液比1∶10（g∶m L）的含0.01%吐溫-80的蒸餾水，在30℃條件下浸提50 min。抽濾，4 000 r/m in離心15 m in，上清即為粗酶液，測定果膠酶酶活。

1.3.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗

（1）有機碳源：在固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入葡萄糖2%、4%、6%、8%、10%，考察葡萄糖的添加量對果膠酶酶活的影響。

（2）無機氮源：在固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入硫酸銨0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，考察硫酸銨的添加量對酶活的影響。

（3）培養(yǎng)溫度：將固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基分別在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃培養(yǎng)72 h，考察溫度對酶活的影響。

（4）培養(yǎng)時間：將固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基在一定溫度下將黑曲霉（Aspergillus niger）BB-6分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，考察培養(yǎng)時間對酶活的影響。

（5）含水量：將固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量分別調(diào)為30%、40%、50%、60%、70%，考察含水量對酶活的影響。

1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取碳源、無機氮源、培養(yǎng)溫度和含水量4個因素進行正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄渣與麩皮的添加比例

表1 葡萄渣和麩皮的不同配比對產(chǎn)酶的影響Table 1 Effect of different ratio of grape promace and wheat bran on pectinase production

相對于初始發(fā)酵培養(yǎng)基（10 g麩皮），添加葡萄渣有利于果膠酶的產(chǎn)生，因為葡萄渣中含有果膠物質(zhì)，而果膠酶屬于誘導酶，葡萄渣既是誘導物又可以作為碳源，所以添加葡萄渣能提高果膠酶的產(chǎn)量。葡萄渣和麩皮的比例合適，不僅對產(chǎn)酶有利，而且還能減少原料的浪費。由表1可知，當葡萄渣與麩皮以5∶5質(zhì)量比混合時酶活最大7.122 U/g。麩皮含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，可以提供碳源、氮源，而且有一定的疏松度，能給黑曲霉的生長提供充足的氧氣。葡萄渣作為誘導物添加到培養(yǎng)基中，隨著葡萄渣含量的增加，果膠酶活力逐漸增提高，若繼續(xù)增加其含量，則酶活隨之下降，可能是葡萄渣含量過高，吸水后容易結(jié)塊，影響氧的傳遞進而影響黑曲霉生長。因此，葡萄渣與麩皮以質(zhì)量比5∶5作為固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為宜。

2.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 有機碳源對產(chǎn)酶的影響

圖1 葡萄糖添加量對酶活的影響Fig.1 Effect of glucose addition on pectinase activity

由圖1可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有機碳源葡萄糖對酶活力有一定的影響，酶活力隨著葡萄糖添加量的增加先升高后降低。一定含量的葡萄糖能提高果膠酶的產(chǎn)量，

而過多的葡萄糖則抑制了酶的產(chǎn)生。當葡萄糖的含量為4%時，酶活力達到最大8.496 U/g。

2.2.2 無機氮源對產(chǎn)酶的影響

圖2 硫酸銨添加量對酶活的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate addition on pectinase activity

硫酸銨是速效無機氮源，在發(fā)酵初期首先被利用，價格低廉，適合于工業(yè)生產(chǎn)。在固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硫酸銨對酶活有一定的影響。由圖2可知，隨著硫酸銨添加量的增加，酶活先升高后降低，當硫酸銨的添加量為0.4%時，酶活力最大為8.709 U/g。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對酶活的影響

將固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基分別放入20～35℃培養(yǎng)72 h，考察培養(yǎng)溫度對酶活的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，培養(yǎng)溫度對酶活力的有一定的影響，適宜的溫度有利于菌體的生長和果膠酶的產(chǎn)生，其最佳產(chǎn)酶溫度為28℃，發(fā)酵時可以控制培養(yǎng)溫度在28～30℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對酶活的影響Fig.3 Effect of culture temperature on pectinase activity

2.2.4 含水量對酶活的影響

水是機體的重要組成部分，培養(yǎng)基的含水量影響菌體細胞的生長繁殖，同時也是產(chǎn)酶的重要影響因素之一。在固態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入30%～70%的水，考察含水量對酶活的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 含水量對酶活的影響Fig.4 Effect of water content on pectinase activity

由圖4可知，培養(yǎng)基含水量為30%～50%，果膠酶酶活力隨著含水量增加而增高；培養(yǎng)基含水量＞50%后，果膠酶酶活力隨著含水量增加而降低；其含水量為50%時，果膠酶活力最大8.343 U/g。培養(yǎng)基含水量低，無法滿足菌體生長所需的水分，產(chǎn)酶較少；培養(yǎng)基含水量過高，培養(yǎng)基容易結(jié)塊，影響氧的傳遞，黑曲霉只能在培養(yǎng)基的表面生長，發(fā)酵不均勻而影響產(chǎn)酶。因此，培養(yǎng)基含水量50%為宜。

2.2.5 培養(yǎng)時間對酶活的影響

培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶非常重要，如果培養(yǎng)時間短，菌體處于生長期，產(chǎn)酶量很少；如果培養(yǎng)時間過長，培養(yǎng)基消耗過多，營養(yǎng)物質(zhì)供應不上，產(chǎn)酶減少，同時菌體在生長代謝中還會產(chǎn)生很多副產(chǎn)物，影響產(chǎn)酶及后期酶的純化。由圖5可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，酶活逐漸增強，72 h時酶活達到最大7.961 U/g，此后繼續(xù)培養(yǎng)，果膠酶活力雖有所下降，但降幅相對較小。因此，培養(yǎng)時間為72 h為宜。

圖5 培養(yǎng)時間對酶活的影響Fig.5 Effect of culture time on pectinase activity

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗

在單因子試驗的基礎(chǔ)上，固定培養(yǎng)時間為72 h，以果膠酶活力作為評價指標，通過正交試驗對菌株產(chǎn)酶條件（葡萄糖添加量、硫酸銨添加量、培養(yǎng)溫度、含水量）進行優(yōu)化，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for culture conditions optimization

由表2可知，4種因素對產(chǎn)酶的影響大小依次為葡萄糖添加量＞含水量＞硫酸銨添加量＞培養(yǎng)溫度，最佳培養(yǎng)基組合是A2B3C4D3，即葡萄糖添加量4%，硫酸銨添加量0.6%，培養(yǎng)溫度30℃、含水量60%。在此最佳條件下進行驗證試驗，測得果膠酶活力為12.226 U/g。由表3可知，葡萄糖的添加量對果膠酶活性有顯著的影響，其他因素對果膠酶活性影響均不顯著。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

3 結(jié)論

葡萄渣作為釀酒行業(yè)的副產(chǎn)物，大多被作為飼料或肥料，甚至作為垃圾直接扔掉，不僅附加值低，還可能會造成環(huán)境污染[13-15]。為了擴大葡萄渣的應用范圍，本研究采用黑曲霉BB-6作為產(chǎn)酶菌株，利用葡萄渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶，對其產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，在麩皮5 g、葡萄渣5 g的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加4%葡萄糖和0.6%硫酸銨，含水量60%，30℃恒溫培養(yǎng)72 h，果膠酶酶活達12.226 U/g，說明利用葡萄渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶是可行的，通過此方法能提高葡萄渣的應用價值。

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《中國釀造》雜志社

Pectinase production by Aspergillus niger solid state fermentation with grape pomace

CAO Keke,LI Yan
(Department of Biology and Food Engineering,Bengbu University,Bengbu 233030,China)

The fermentation conditions of Aspergillus niger BB-6 by solid-state fermentation with grape pomace for pectinase production were studied.The results showed that the optimal culture condition for the basic fermentation culture medium was glucose 4%,ammonium sulfate 0.6%, water content 60%.Under the condition of 30℃,the activity of pectinase could reach 12.226 U/g at 72 h.

Q939.97

A

0254-5071（2015）03-0083-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.019

2015-01-19

蚌埠學院自然科學研究項目（2011ZR16）；蚌埠學院優(yōu)秀中青年骨干教師培養(yǎng)計劃

曹珂珂（1980-），女，講師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵。