鐘浩博，孫春漢，馬 晉，鄭少偉，陳楚群，賴偉強(qiáng)，楊劍鋒，孫江森

惠州市第一人民醫(yī)院骨科，廣東 惠州 516001

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種累及周圍關(guān)節(jié)組織為主的自身免疫性疾病，以非化膿性增生性滑膜炎為特點(diǎn)，形成侵襲性血管翳，逐漸導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞及關(guān)節(jié)功能的障礙［1］。在RA的發(fā)病機(jī)制中，成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synovial cells,FLS）可以分泌促炎因子TNF-a、IL-1β等，參與關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)破壞［2-3］。乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1）是一類重要的抑制轉(zhuǎn)移的基因［4］，新近發(fā)現(xiàn)BRMS1也有抑制有促炎作用的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核轉(zhuǎn)位的作用［5］。那么，BRMS1在RA中是否可以抑制NF-kB介導(dǎo)的炎癥，尚不可知。因此，本研究旨在探討B(tài)RMS1在RA中的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

高糖型DMEM、胎牛血清（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司）。IL-1β Elisa試劑盒（美國BD公司）。BRMS1、p-IkKa/b、IkKa/b 、IkBa、NF-κB和IL-1β抗兔二抗（美國CST公司）。核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒（凱基生物技術(shù)公司）。脂多糖（LPS）（日本日本化藥株會社）。

1.2 取材和FLS原代分離。

4例符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ARA）修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)［3］的女性病人滑膜標(biāo)本，取自惠州市第一人醫(yī)院骨外科行關(guān)節(jié)置換或關(guān)節(jié)鏡手術(shù)患者，4℃保存。病人年齡37～58歲，平均47±13歲，病程6～19年，平均10±8.4年。另外分別取1名外傷手術(shù)無關(guān)節(jié)疾病患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織。參照黃憲章等［6］人的方法分離原代FLS。無菌條件下剪碎，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，吸棄過多培養(yǎng)基。用無菌吸管吸氣組織塊，均勻噴灑于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，倒置培養(yǎng)瓶，加入4 ml 10%培養(yǎng)基。在5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)12 h后緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后可見組織塊周圍有大量細(xì)胞，可用PBS沖洗去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿至70%左右消化傳代。本實(shí)驗中采用3～5代滑膜成纖維細(xì)胞，型別均一，純度可達(dá)98%。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染

由吉凱公司合成慢病毒。第三代處于對數(shù)生長期的滑膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為1×106）接種于12孔板中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到約50%。按MOI值（病毒滴度/細(xì)胞數(shù)）50，加入適宜量的病毒。12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)：如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基。感染72 h后觀察細(xì)胞熒光率，同時收集部分細(xì)胞Western blot檢測BRMS表達(dá)變化。

1.4 Western blot檢測蛋白水平。

60 mm皿收集細(xì)胞，按凱基核蛋白提取試劑盒（貨號KGP150）說明提取核蛋白及胞漿蛋白。Bradford法測定蛋白濃度。5%濃縮膠80 V衡壓30 min，10%分離膠恒壓110 V，40 min，濕轉(zhuǎn)120 mA恒流50 min，37℃搖床5%BSA封閉2 h，轉(zhuǎn)印后加入一抗4℃過夜。TBST洗膜5 min×3次，山羊抗兔或山羊抗鼠近紅外二抗 1∶15000，常溫避光搖床孵育1.5 h，避光TBST洗膜15 min×4次。Odyssey V3.0掃描儀掃描膜。重復(fù)3次。

1.5 Elisa檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β。

以含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液為封閉液，每孔350 μl，室溫封閉 1 h。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，洗板，加入待測樣品（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)Purified Rat IgG代替樣品）100 μl，室溫25±2 ℃孵育 2 h。一抗孵育結(jié)束后，洗板，每孔加入Anti-rat IgG-HRP Antibody 100 μl，室溫孵育2 h。酶標(biāo)二抗孵育結(jié)束后，洗板，每孔加入TMB底物溶液100 μl，室溫避光顯色30 min后，每孔加入2 mol/L H2SO450 μl終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

1.6 免疫熒光檢測NF-κB核轉(zhuǎn)位。

處理好細(xì)胞后，去除培養(yǎng)基，PBS洗1次，多聚甲醛固定 20 min，PBS洗3次，每次3 min；2.5%Triton-100室溫封閉 10 min，PBS洗3次，每次3 min；200 μl FBS室溫封閉 1 h，滴加1∶200稀釋50 μl NF-kB一抗，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3 min；然后加1∶200 FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗200 μl，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min；最后用DAPI染核，室溫避光孵育5 min，PBS洗3次，每次3 min；在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用One-way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗，確定方差齊性且整體比較組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義后進(jìn)一步作多重比較，多重比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA組FLS細(xì)胞BRMS1蛋白、核蛋白中NF-κB表達(dá)和培養(yǎng)基上清中IL-1β水平

收集第3代FLS細(xì)胞提取總蛋白、核蛋白及胞漿蛋白，Western blot檢測BRMS1蛋白、核蛋白中NF-kB表達(dá)。結(jié)果顯示，RA組FLS細(xì)胞BRMS1和IkBα蛋白較normal組明顯降低，但是IkKα/β磷酸化水平及核蛋白中NF-κB表達(dá)較normal組明顯升高（圖1A）。Elisa結(jié)果顯示，RA組培養(yǎng)基中IL-1β水平也較normal組明顯升高（圖1B）。

圖1 RA組FLS細(xì)胞BRMS1蛋白、核蛋白中NF-kB表達(dá)和培養(yǎng)基上清中IL-1β水平的差異

2.2 過表達(dá)BRMS1下調(diào)NF-κB核轉(zhuǎn)位和IL-1β表達(dá)

慢病毒法在RA組FLS中過表達(dá)BRMS1，Western blot檢測結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染BRMS1后，F(xiàn)LS細(xì)胞BRMS1表達(dá)明顯升高（圖2A）。進(jìn)一步檢測胞漿蛋白中IkKα/β磷酸化水平和IkBα蛋白表達(dá)，核蛋白中NF-kB的表達(dá)水平。結(jié)果顯示過表達(dá)BRMS1后，IkBα蛋白表達(dá)增加，IkKα/β磷酸化水平及核蛋白中NF-κB的表達(dá)水平明顯減少（圖2A）。免疫組化結(jié)果可見，過表達(dá)BRMS1后，細(xì)胞核中NF-κB明顯減少（圖2B）。Elisa檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)BRMS1組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-1β水平明顯下調(diào)（圖2C）。

圖2 過表達(dá)BRMS1對NF-κB核轉(zhuǎn)位和IL-1β表達(dá)的影響

2.3 過表達(dá)BRMS1抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位和IL-1β表達(dá)

Normal組的FLS細(xì)胞過表達(dá)BRMS1后，予LPS 10 ng/ml處理1 h后提取蛋白。Western blot檢測結(jié)果顯示，BRMS1+LPS組IkKα/β磷酸化及核蛋白中NF-κB水平較NC+LPS組明顯減少（圖3A）。培養(yǎng)基上清Elisa檢測結(jié)果顯示，BRMS1+LPS組IL-1β也較NC+LPS組明顯減少（圖3B）。

3 討論

成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）是關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)層主要的細(xì)胞之一。在正常正常情況下，F(xiàn)LS在保持關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要功能。但是在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的關(guān)鍵滑膜組織中，F(xiàn)LS除了呈腫瘤樣增生，造成細(xì)胞數(shù)量的大量增加，造成軟骨破壞的一個重要原因；另一方面，F(xiàn)LS可以對許多促炎癥因子有響應(yīng)，而且其自身也能夠合成并分泌許多因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［7］，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，使血液中的白細(xì)胞被匯集到關(guān)節(jié)腔內(nèi)；刺激軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞、骨膜細(xì)胞，使糖蛋白的合成減少、降解增加，同時產(chǎn)生釋放骨鈣的膠原酶和其他中性蛋白酶，從而導(dǎo)致軟骨和骨破壞［8-9］。

核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B（NF-κB）在FLS分泌炎癥因子中有重要作用。在RA的FLS中，NF-kB活化可以促進(jìn)IL-1β、IL-8、IL-6、MMPs的產(chǎn)生，促進(jìn)FLS增生，抑制FLS凋亡，從而促進(jìn)滑膜血管翳形成，使細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子和MMPs，進(jìn)一步增強(qiáng)IkKβ的功能，誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)錄，形成惡性循環(huán)［10-12］。我們的實(shí)驗結(jié)果也顯示，在RA病人的FLS中，NF-κB通路的活化較normal組明顯升高。Okamoto等［13］也發(fā)現(xiàn)，通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位可以明顯改善RA病人的并且進(jìn)展?？梢?，NF-κB在FLS參與破壞RA病人關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)過程中有重要作用。

圖3 過表達(dá)BRMS1對LPS誘導(dǎo)的NF-kB核轉(zhuǎn)位和IL-1β表達(dá)的影響

BRMS1在抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中有重要作用［14］；同時，研究也發(fā)現(xiàn)BRMS1可以抑制IkKα/β磷酸化，減少IkBα蛋白降解，從而抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位和該通路的活化［5］。我們對比了正常的和RA患者的FLS細(xì)胞中BRMS1蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RA患者FLS細(xì)胞中BRMS1蛋白表達(dá)明顯下降。而在RA患者的FLS細(xì)胞中，過表達(dá)BRMS1蛋白后，NF-κB的核轉(zhuǎn)位被明顯抑制，同時IL-1β的分泌明顯減少。為了進(jìn)一步明確BRMS1蛋白對NF-κB的作用，在normal組的FLS細(xì)胞中過表達(dá)BRMS1蛋白，再用NF-κB通路的激活劑LPS刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BRMS1可以減弱LPS誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活和IL-1β的分泌。

綜上所述，BRMS1可以通過抑制NF-kB核轉(zhuǎn)位，抑制FLS分泌炎癥因子IL-1β，這可能成為治療RA的一個靶點(diǎn)。

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