常珠俠

（安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司，安徽蚌埠 233010）

L-亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基及基本發(fā)酵條件的優(yōu)化

常珠俠

（安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司，安徽蚌埠 233010）

以黃色短桿菌FY-18為出發(fā)菌株，利用搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸，并利用正交試驗和單因素試驗分別對其發(fā)酵培養(yǎng)基和基本發(fā)酵條件進行研究，從而優(yōu)選出最佳培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件參數(shù)。結(jié)果表明，L-亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的最適配比為：葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米漿20 g/L、毛發(fā)粉15 g/L、硫酸銨70 g/ L；其發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件為：初始pH 7.2，培養(yǎng)溫度32℃，發(fā)酵接種量為10%。在上述最佳條件下?lián)u瓶中發(fā)酵的產(chǎn)酸量為22.5 g/L。

L-亮氨酸；菌種；發(fā)酵；正交試驗

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是生物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)成分，在生物體內(nèi)具有特殊的生理功能，參與細胞中多種化合物的合成代謝。L-亮氨酸是常見的18種氨基酸之一，也是人體8種必需氨基酸之一，于1819年由Proust首先從奶酪中分離得到，后來Braconnot從肌肉與羊毛的酸水解物中得到其結(jié)晶。

L-亮氨酸在醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等行業(yè)具有重要用途。由于L-亮氨酸和L-異亮氨酸、L-纈氨酸的分子結(jié)構(gòu)中都含有一個甲基側(cè)鏈，故被稱為支鏈氨基酸［1～2］。在醫(yī)藥行業(yè)，L-亮氨酸主要用于復(fù)合結(jié)晶氨基酸靜脈注射液，可維持危重病人的營養(yǎng)需求。L-亮氨酸還可用于合成具有抗癌、抗病毒、抑制細菌生長等生物活性的L-亮氨酸Schiff堿Cu2+、Ni2+、Zn2+配合物。另外，選用L-亮氨酸作為氨基酸部分的N-稀有脂肪?；?L-亮氨酸具有較高抗菌活性［1］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，亮氨酸的添加可抑制敗血癥引起的骨骼肌蛋白質(zhì)合成減少，從而緩解其帶來的體重下降等負(fù)面效應(yīng)。L-亮氨酸可用于診斷和治療小兒突發(fā)性高血糖癥和作為頭暈治療及營養(yǎng)滋補類藥物。L-亮氨酸與稀土的配合物是氨基酸肥料和農(nóng)藥的一種，不僅能增產(chǎn)，防止農(nóng)作物病蟲害，并且能被日光和微生物降解，是目前深受人們喜愛的“綠色農(nóng)藥”。由L-亮氨酸合成的多聚物是臨時創(chuàng)傷敷料的最佳原料之一，也極具發(fā)展?jié)撡|(zhì)［3］。

由于L-亮氨酸在多個行業(yè)均有重要應(yīng)用，而目前總體狀況是供不應(yīng)求，故有關(guān)其生產(chǎn)的研究，特別是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-亮氨酸是未來一段時間內(nèi)極為重要的研究領(lǐng)域。我們利用黃色短桿菌FY-18對發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的工藝條件進行了初步優(yōu)化研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種黃色短桿菌FY-18為安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司菌種室保藏。

1.1.2 儀器設(shè)備培英DZ-900振蕩器（太倉市實驗設(shè)備廠）；7230G可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1200，安捷倫科技有限公司）；生物傳感分析儀SBA-40C（山東省科學(xué)院生物研究所）等。

1.1.3 培養(yǎng)基種子液體搖瓶培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖2.00 g，磷酸氫二鉀0.50 g，硫酸鎂1.00 g，硫酸亞鐵0.02 g，硫酸銨0.50 g，豆粕水解液150 mg，蛋氨酸40 mg，玉米漿0.50 g，谷氨酸4.00 g，瓊脂粉1.50 g。發(fā)酵液體搖瓶培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖10.00 g，磷酸氫二鉀0.50 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸亞鐵0.02 g，硫酸銨7.00 g，豆粕水解液2.00 g，蛋氨酸60 mg，玉米漿2.00 g，毛發(fā)粉1.50 g， L-異亮氨酸5 mg。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子固體平板培養(yǎng)方法將上述種子液體搖瓶培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉后制得平板培養(yǎng)基，再用NaOH調(diào)pH至7.0，121℃30 min滅菌后，冷卻至50℃以下，待平板培養(yǎng)基凝固后涂布接種，并在恒溫培養(yǎng)箱中32℃培養(yǎng)24 h，待用。

1.2.2 種子液體搖瓶培養(yǎng)方法將上述種子培養(yǎng)基配制完成后，用NaOH調(diào)pH至7.2，121℃滅菌20 min，每只搖瓶中添加4 gCaCO3（預(yù)先150℃干熱滅菌準(zhǔn)備好），從固體平板上選取一接種環(huán)的菌體接入搖瓶中，裝液量為100 mL/500 mL，培養(yǎng)條件31.5℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。種子合格標(biāo)準(zhǔn)為：培養(yǎng)時間約24 h，菌體OD值（620 nm）1.2。

1.2.3 發(fā)酵液體搖瓶培養(yǎng)方法將上述發(fā)酵培養(yǎng)基配制完成后，用NaOH調(diào)pH至7.2，121℃滅菌20 min，每只搖瓶中添加4 g CaCO3（預(yù)先150℃干熱滅菌準(zhǔn)備好），從培養(yǎng)合格的種子液中吸取1 mL菌液接入搖瓶中，裝液量為100 mL/500 mL，培養(yǎng)條件31.5℃，搖床轉(zhuǎn)速300 r/min。

1.2.4 分析和測定方法［4］①L-亮氨酸液相測定。將發(fā)酵液做一定處理后，用高效液相色譜法定量測定發(fā)酵液中游離的L-亮氨酸含量。②發(fā)酵液菌體濃度測定。發(fā)酵液中菌體濃度采用菌體溶液吸光度A620nm表示。取發(fā)酵液0.5 mL，加入9.5 mL 0.1 mol/L稀鹽酸中和碳酸鈣，混勻，分光光度計620 nm波長下用蒸餾水做空白進行比色，比色結(jié)果記為A620nm。③發(fā)酵液殘?zhí)堑臏y定。采用生物傳感分析儀進行殘?zhí)堑臏y定。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基關(guān)鍵組分含量的優(yōu)化

對于發(fā)酵產(chǎn)酸而言，種子培養(yǎng)基的作用主要在于培養(yǎng)得到較多的菌體，而發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及含量對于產(chǎn)物的合成速度及產(chǎn)量有著更至關(guān)重要的影響。因此有必要對發(fā)酵培養(yǎng)基進行研究，通過小試試驗得到的數(shù)據(jù)，并對試驗結(jié)果進行整理和分析，從而優(yōu)選出最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

L-亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方的關(guān)鍵組分有葡萄糖（A）、豆粕水解液（B）、玉米漿（C）、毛發(fā)粉（D）、硫酸銨（E）等［5］。其中，葡萄糖是碳源，也是能源，所以需要優(yōu)先考慮葡萄糖對發(fā)酵的影響；豆粕水解液、玉米漿、毛發(fā)粉等是有機氮源，其中含有微生物生長所必需的部分微量元素、氨基酸、維生素等，也是發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組成成分；而硫酸銨是無機氮源，這些都是發(fā)酵培養(yǎng)基的關(guān)鍵因素。通過L16（45）正交試驗對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基的關(guān)鍵營養(yǎng)成分進行優(yōu)化，其結(jié)果見表1和表2。

如表2所示，主要亮氨酸產(chǎn)量指標(biāo)。對其分析計算，如Kx＝N1+N2+N3+N4（x為1、2、3、4，N即為A、B、C、D、E），kx=Kx/4。得到最優(yōu)方案為A4B3C3D3E4，即葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米漿20 g/L、毛發(fā)粉15 g/L、硫酸銨70 g/L。以此最優(yōu)方案為發(fā)酵培養(yǎng)基配方的主要成分的含量為條件，得出試驗結(jié)果為22.5 g/L，即最佳產(chǎn)酸結(jié)果。

創(chuàng)新決定高度，實干鑄就輝煌。沒有創(chuàng)新實干的精神，就沒有遼寧曾經(jīng)的勝利；沒有創(chuàng)新實干的精神，更不可能有遼寧明天的輝煌。習(xí)近平總書記指出， “惟創(chuàng)新者進，惟創(chuàng)新者強，惟創(chuàng)新者勝?！痹谶@種創(chuàng)新精神的指引下，在實干態(tài)度的生發(fā)下，遼寧人民在今后的發(fā)展過程中會繼續(xù)披荊斬棘，以創(chuàng)新的理論、創(chuàng)新的制度、創(chuàng)新的文化、創(chuàng)新的科技，去再創(chuàng)遼寧老工業(yè)基地的發(fā)展新高。

表1 L16（45）正交試驗因子水平

表2 L16（45）正交試驗數(shù)據(jù)及結(jié)果分析

2.2 利用單因素試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基本條件的優(yōu)化

生物發(fā)酵過程實際上是由眾多生物化學(xué)反應(yīng)所構(gòu)成的綜合反應(yīng)過程，除了目的產(chǎn)物之外，還會生成許多副產(chǎn)物。而影響發(fā)酵過程的幾大關(guān)鍵因素，例如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH和種齡等控制參數(shù)的變化對發(fā)酵產(chǎn)物的生成速率、產(chǎn)量以及副產(chǎn)物的形成都有著顯著的影響。因此，需要通過搖瓶的單因素對照試驗來確定上述最佳的基本條件參數(shù)［6］。

2.2.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化溫度是影響微生物生長代謝的基本環(huán)境因素之一。微生物發(fā)酵產(chǎn)物的的生成、菌體的生長與繁殖都與相關(guān)生物化學(xué)反應(yīng)中酶的活性有著直接的關(guān)系，而酶活對溫度的變化很敏感，合適的溫度將有利于酶促反應(yīng)，促進目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。試驗利用搖瓶培養(yǎng)方式進行L-亮氨酸的發(fā)酵，考察26～36℃時菌株的生長和產(chǎn)酸情況，從而優(yōu)選出最佳的培養(yǎng)溫度。

試驗利用搖瓶進行培養(yǎng)發(fā)酵，除溫度以外，其他的培養(yǎng)條件均相同，培養(yǎng)30 h后，分別對不同搖瓶的L-亮氨酸含量進行測定并進行對照分析。由圖1可知，32℃為L-亮氨酸最佳的培養(yǎng)溫度，30 h L-亮氨酸含量達到23.6 g/L。而26℃和36℃時，L-亮氨酸含量分別為18.3 g/L和15.8 g/L?？梢姡捎跍囟葘w生長及發(fā)酵相關(guān)酶系的影響，過高或過低的溫度都極大地影響L-亮氨酸的發(fā)酵水平。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對L-亮氨酸含量的影響

2.2.2 發(fā)酵接種量的優(yōu)化接種量是指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌株繁殖達到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成，而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。

試驗利用搖瓶進行培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵搖瓶的接種方式為利用無菌操作吸取同一瓶成熟的種子培養(yǎng)液，然后按照不同的接種量添加入發(fā)酵搖瓶進行培養(yǎng)，其他的培養(yǎng)條件均相同，在培養(yǎng)30 h后，分別對不同搖瓶的L-亮氨酸含量進行測定并進行對照分析。如圖2所示，10%為最佳的接種量，用10%的接種量培養(yǎng)30 h時，L-亮氨酸的含量達到22.5 g/L；用12%的接種量時，L-亮氨酸的含量也達到22.3 g/L。而接種量為6%時，L-亮氨酸的產(chǎn)量最低，其次是接種量16%。分析原因為接種量過小，造成前期菌量少，生長停滯期較長，從而延長了整個發(fā)酵周期；接種量過大時，耗氧旺盛，而搖瓶中往往通氣條件受限，造成溶氧過低影響發(fā)酵。

圖2 不同接種量對L-亮氨酸含量的影響

2.2.3 初始pH的優(yōu)化微生物培養(yǎng)環(huán)境的pH對其生長繁殖、營養(yǎng)代謝都有著極大的影響，而不同種類的微生物以及不同產(chǎn)物的生產(chǎn)菌所需要的最適pH都有著很大差別，因此，有必要對L-亮氨酸生產(chǎn)菌的最適產(chǎn)酸pH進行初步研究。

試驗利用搖瓶進行培養(yǎng)發(fā)酵，利用酸堿試劑對發(fā)酵搖瓶的初始pH進行調(diào)節(jié)，其他的培養(yǎng)條件均相同，在培養(yǎng)30 h后，分別對不同搖瓶的L-亮氨酸含量進行測定并進行對照分析。發(fā)酵所用菌種黃色短桿菌為腸道桿菌，一般最適生長pH為7.0左右。如圖3所示，在搖瓶發(fā)酵中最高產(chǎn)酸的初始pH為7.2，其次為pH7.6，L-亮氨酸含量分別為22.5 g/L和23.2 g/L，過高或過低的pH對其含量有著極大影響。考慮到搖瓶發(fā)酵不能調(diào)控pH，過程pH或因為發(fā)酵產(chǎn)生有機酸而不斷下降，造成中后期發(fā)酵受到抑制。因此，在利用發(fā)酵罐進行L-亮氨酸發(fā)酵，且能夠用堿液維持過程pH時，控制pH為7.2可作為L-亮氨酸發(fā)酵生產(chǎn)最佳培養(yǎng)條件。

圖3 不同初始pH對L-亮氨酸含量的影響

3 小結(jié)與討論

1）利用搖瓶正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基中關(guān)鍵組分含量進行優(yōu)化，最終確定葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米漿20 g/L、毛發(fā)粉15 g/L、硫酸銨70 g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基組分最優(yōu)化配方。通過搖瓶單因素對照試驗，最終確定產(chǎn)酸的最佳發(fā)酵基本培養(yǎng)條件為發(fā)酵接種量10%，培養(yǎng)溫度32℃，初始pH為7.2。

2）要實現(xiàn)L-亮氨酸發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)，還有許多研究工作要做。首先，菌種還需要繼續(xù)進行改良，使其能耐更高的葡萄糖濃度、縮短發(fā)酵時間、提高L-亮氨酸產(chǎn)量、減少雜質(zhì)和雜酸的產(chǎn)生等。除了基本的誘變技術(shù)如紫外線誘變、化學(xué)制劑誘變等外，體內(nèi)、體外的基因重組等基因工程技術(shù)也可應(yīng)用于構(gòu)建性狀優(yōu)良的高產(chǎn)菌株，例如細胞融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等。其次，工業(yè)發(fā)酵的工藝參數(shù)也要進一步優(yōu)化，特別是逐級放大發(fā)酵的過程中，大多數(shù)工藝參數(shù)都將有所變化，要獲得穩(wěn)定的L-亮氨酸產(chǎn)量就要不斷摸索各種條件。L-亮氨酸的提取也是生產(chǎn)L-亮氨酸很重要的一步工藝，也可以從提取過程工藝條件的優(yōu)化方面考慮生產(chǎn)的改良。

［1］中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司.試劑手冊［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

［2］伍時華，方杰，陳寧.L-亮氨酸高產(chǎn)菌的代謝控制育種［J］.生物科技通訊，2001，12（3）：27-30.

［3］張克旭.代謝控制發(fā)酵［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2007.

［4］沈同，王鏡巖.生物化學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，1990.

［5］FREUNDLICH M，BURNS RO，UMBARGER HE.Control of isoleucine，valine，and leucine biosynthesis.I. Multivalent repression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1962，48：1 804-1 808.

［6］UMBARGER HE，BROWN B.Threonine deamination in Escherichia coli.Ⅱ.Evidence for two L-threonine deaminases［J］.J.Bacteriol，1957，73：105-112.

（本文責(zé)編：鄭丹丹）

Optimization of Medium Components and Cultural Conditions of L-leucine

CHANG Zhu-xia
（Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co.，Ltd.，Bengbu Anhui 233010，China）

Brevibacterium flavum FY-18 was used as original strain to produce L-leucine by shaking flask fermentation.The orthogonal experiments and single factor experiments were adopted to optimize the fermentation culture medium and conditions of L-leucine.The results indicated that the optimized compositions of medium were 160 g/L glucose，20 g/L soybean meal hydrolysate，20 g/L corn steep liquor，15 g/L hair powder and 70 g/L ammonium sulfate，and the fermentation conditions were initial pH at 7.2，32℃and inoculum 10%.Under the optimized fermentation conditions the production of L-leucine was up to 22.5 g/L.

L-leucine；Strain；Fermentation；Orthogonal Experiment

TQ922

A

1001-1463（2015）04-0007-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.04.003

2015-02-11

常珠俠（1962—），女，安徽蚌埠人，高級工程師，主要從事生物工程技術(shù)研究。聯(lián)系電話：（0）18055263388。E-mail：changzhuxia6209@163.com