王 浩， 趙 麗 ， 楊紅梅， 潘紅艷， 史海良， 錢 聰， 張 杉

（國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，北京100094）

抗生素是由細菌、放線菌、真菌等微生物經(jīng)過培養(yǎng)而得到的次級代謝產(chǎn)物，它可有效地抑制病原微生物的生長、繁殖或直接殺滅病原微生物。廣義的抗生素還包括一些用化學方法合成的、有類似作用的人工合成抗菌藥物（如磺胺等）?？股氐难兄?、篩選、合成對保障人類健康、促進畜牧生產(chǎn)水平提高、滿足人類對動物性食品需求等方面做出了巨大貢獻。但過量使用抗生素會降低畜牧產(chǎn)品的品質(zhì)，影響乳品發(fā)酵；而且殘留有抗生素的動物性產(chǎn)品進入人類食物鏈，會使體內(nèi)菌株產(chǎn)生抗生素抗性，擾亂機體內(nèi)環(huán)境平衡，導致菌群失調(diào)；也會使易感人群產(chǎn)生過敏反應、激素障礙變態(tài)反應。面對抗生素濫用對公眾健康的威脅，美國食品和藥物管理局（FAO）及世界衛(wèi)生組織（WHO）早在1969 年就規(guī)定了各種動物性食品中抗生素的殘留允許標準，WHO 于1979 年規(guī)定原料奶及消毒牛奶中不得有抗生素。美國FDA 調(diào)查表明，泌乳期乳牛用藥不當或不注意安全時間是牛乳中抗生素殘留的主要原因。一些不法乳品生產(chǎn)商戶在高溫季節(jié)為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，通過抑制細菌生長以達到防止牛奶酸敗的目的，這也是牛乳中抗生素殘留的一個來源。

目前，檢測抗生素的方法有微生物法［1］、酶聯(lián)免疫法［2］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［3］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等［4-8］。微生物法簡單、費用少、速度快，但特異性差，易受其他抗生素影響，且靈敏度不高，檢出限較高。酶聯(lián)免疫法雖有靈敏度高、前處理簡單、測定速度快等優(yōu)點，但檢測結(jié)果存在假陽性；目前，國際上常用的抗生素確證方法為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，但是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法存在前處理步驟繁瑣、有機試劑消耗量大、測定周期長等缺點。目前，牛奶中四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素殘留雖然都有標準檢測方法，但都存在著操作復雜、溶劑毒性大、費時，不適于大量樣品的快速篩查等問題。針對上述問題，本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS／MS）技術快速測定和確證牛奶中35 種四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素殘留，具有操作簡單、靈敏度高、回收率穩(wěn)定、測定周期短等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6410 型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（美國Agilent公司），配Agilent 1200 型液相色譜儀；GL-88b 型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ-5200 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海市亞榮生化儀器廠）；Milli-Q 去離子水發(fā)生器（美國Millipore 公司）。

乙腈、甲醇、甲酸（色譜純）；乙酸銨（優(yōu)級純）；乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉（分析純）；二甲胺四環(huán)素、四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素、甲烯土霉素、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺索嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲基異惡唑、磺胺多辛、磺胺地索辛、甲氧芐啶、磺胺甲二唑、磺胺喹沙啉、鄰氯青霉素、雙氯青霉素、乙氧萘胺青霉素、苯唑青霉素、芐青霉素、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、苯氧乙基青霉素、紅霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素等35 種抗生素標準品均購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司，純度為98% ～99%。

1.2 分析條件

1.2.1 色譜條件

條件一（適用于四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素） Eclipse XDB-C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流速：0.25 mL／min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A 為10.0 mmol／L 乙酸銨（含0.35% 甲酸），B 為甲醇；梯度洗脫程序：0 ～3 min，5% B；3 ～20 min，5% B ～25% B；20 ～25 min，25% B ～50% B；25 ～30 min，50% B ～100% B；30 ～35 min，100% B。

條件二（適用于氯霉素類抗生素） Eclipse XDB-C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流速：0.25 mL／min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A 為0.05% 氨水溶液，B 為甲醇；梯度洗脫程序：0 ～3 min，5% B；3 ～5 min，5% B ～100% B；5～12 min，100% B。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）源；掃描方式：四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為正離子模式，氯霉素類抗生素為負離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；干燥氣：N2；霧化氣壓力：275.8 kPa；干燥氣溫度：340 ℃；干燥氣流速：10 L／min。

1.3 樣品處理

稱取5.00 g 樣品（精確至0.01 g），置于25 mL比色管中，先加入3 mL 0.1 mol／L Na2EDTAMcllvaine 緩沖液，渦旋1 min，再用含1% （v／v）氨水的乙腈溶液定容。超聲波提取20 min，上清液經(jīng)濾紙過濾，吸取10.0 mL 濾液至100 mL 雞心瓶內(nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于50 ℃水浴中減壓濃縮至近干，加入2.0 mL 含1% （v／v）氨水的30% 甲醇水溶液充分溶解后過0.22 μm 濾膜，濾液用于LCMS／MS 測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

在質(zhì)譜MRM 模式下，樣品基質(zhì)對測定的干擾較小，且色譜柱具備一定的分離凈化功能，確保極性較強的雜質(zhì)在4 min 之前被洗脫在質(zhì)譜儀之外，這樣能大大地減輕對質(zhì)譜儀的污染。故在實驗設計時考慮采用較為簡單和經(jīng)濟的液-液分配方法進行樣品前處理。

2.1.1 提取溶劑的選擇

四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素的化學性質(zhì)差異較大。本實驗分別以乙腈、Mcllvaine 緩沖液-乙腈、Mcllvaine 緩沖液-堿性乙腈和Mcllvaine 緩沖液-酸性乙腈作為提取劑進行比較，發(fā)現(xiàn)乙腈作提取劑時，多數(shù)目標化合物的回收率在50% 與90% 之間，而四環(huán)素類的回收率不足20%。以Mcllvaine 緩沖液-乙腈為提取劑時紅霉素的回收率不足40%。Mcllvaine 緩沖液-酸性乙腈作為提取劑時氯霉素類抗生素回收率下降了15%，同時檢測靈敏度降低1 ～2 倍。Mcllvaine 緩沖液-堿性乙腈作為提取劑時各類化合物的平均回收率為60% ～105%，可以滿足檢測要求。

2.1.2 定容溶劑的選擇

本實驗發(fā)現(xiàn)以流動相作為定容溶劑時，各目標化合物的峰形良好，但紅霉素的靈敏度偏低，因此本實驗選擇甲醇-水為定容溶劑并對兩者的比例（9 ∶1、7 ∶3、5 ∶5、3 ∶7、1 ∶9，v／v）進行考察。結(jié)果表明，當甲醇比例較低時，目標物的峰形和靈敏度較好，但對旋蒸濃縮后的樣品提取物進行復溶時，不能完全溶解殘留在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶壁上的目標物，導致部分目標物回收率偏低；提高甲醇比例，其對目標物的溶解性增加但峰形變差，最終本實驗選擇甲醇-水（3 ∶7，v／v）為定容溶劑，同時考慮到紅霉素和氯霉素類抗生素的特性，在其中加入1% （v／v）氨水。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進樣方式將35 種質(zhì)量濃度為100 μg／L 的四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素標準工作溶液分別注入離子源中，在正離子或負離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到目標化合物的分子離子峰。根據(jù)歐盟2002／657／EC 指令規(guī)定對于質(zhì)譜確證方法必須達到4 個確證點的要求，低分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測應在確定母離子的基礎上選擇兩個以上的子離子。以分子離子為母離子進行二級質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù)如碎裂電壓、碰撞能量等進行優(yōu)化，使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對強度達到最大。得到的四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類35 種抗生素的最佳質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇

為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善，本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）、XDB C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）、ZORBAX SB-Aq 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、Eclipse XDB-C8色譜柱，（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）進行分離試驗，發(fā)現(xiàn)Eclipse XDB-C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）對于全部目標化合物分離效果較好，其他色譜柱對四環(huán)素類物質(zhì)都存在分離效果不理想的問題。

2.3.2 色譜分離條件的選擇

選擇流動相時應兼顧分離效果及各分離組分的離子化效率，以獲得最佳的分辨率和最高的靈敏度。由于抗生素易溶于甲醇或乙腈，試驗分別選擇甲醇和乙腈作為強洗脫流動相。用乙腈作為流動相時目標化合物的分離效果明顯低于甲醇作為流動相時的效果，因此最終選擇甲醇作為強洗脫流動相。在水相中加入乙酸銨后，磺胺類和青霉素類抗生素加氫離子峰強度離子化效率明顯提高。在水相中加入0.35% 的甲酸是為了提高待測物在電噴霧離子源中的正離子化效率，以提高靈敏度，同時四環(huán)素類能形成較好的色譜峰。因此，最終選用10.0 mmoL／L 乙酸銨（含0.35% 甲酸）-甲醇作為流動相。

表1 35 種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Instrumental parameters for mass spectrometric analysis of the 35 antibiotics

四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類等4類抗生素結(jié)構差異較大，本方法在色譜條件一中利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測效果，測試開始時，流動相中10.0 mmoL／L 乙酸銨（含0.35% 甲酸）-甲醇的比例為95 ∶5，然后在0 ～3 min 內(nèi)保持此比例，目的是洗脫待測液中極性較強的雜質(zhì)；3 ～20 min 內(nèi)將二者的比例逐步變?yōu)?5 ∶25，目的是分離待測液中極性較強的磺胺類抗生素；20 ～25 min 內(nèi)將二者的比例逐步變?yōu)?0 ∶50，目的是分離待測液中中等極性的磺胺類抗生素；25 ～30 min 內(nèi)將二者的比例逐步變?yōu)? ∶100，30 ～35 min 內(nèi)保持此比例，目的是分離待測液中極性較弱的磺胺類抗生素以及四環(huán)素類、青霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。通過上述3 步梯度洗脫，在35 min 內(nèi)，可以較好地分離待測液中四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類等4 類抗生素。在色譜條件二中也采用梯度洗脫，將3 種氯霉素類抗生素有效分離。

2.3.3 進樣量的選擇

進樣量大可提高測定的靈敏度，但容易污染色譜柱。實驗發(fā)現(xiàn)，當進樣量達到10 μL 時，靈敏度能達到要求，且對色譜柱影響不大。

2.4 線性范圍與檢出限

用空白樣品提取液逐級稀釋標準工作液，分別進樣10 μL，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸（y 為峰面積；x 為含量，μg／kg）；同時用空白樣品進行加標實驗，將信噪比為3 條件下對應的被測物含量定為檢出限。結(jié)果見表2。

表2 35 種抗生素的線性回歸方程、線性范圍、線性相關系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equations，linear ranges，correlation coefficients （r）and limits of detection （LOD）of the 35 antibiotics

2.5 方法的回收率和精密度

每組準確稱取空白樣品6 份，每份5.00 g，共3組，分別定量加入目標對照品，第一組添加水平：四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類抗生素均為10.0 μg／kg，氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均為1.0 μg／kg；第二組添加水平：四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類抗生素均為25.0 μg／kg，氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均為2.5 μg／kg；第三組添加水平：四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類抗生素均為50.0 μg／kg，氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均為5.0 μg／kg。按供試品溶液制備方法制備后進行測定，結(jié)果見表3。

從表3 可見，平均加標回收率為70.1% ～109.9%，平均相對標準偏差為2.89% ～9.99% （n ＝6）。

表3 目標物在空白樣品中的加標回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations （RSDs）of the targets spiked in samples （n＝6）

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

2.6 實際樣品檢測

為了解我國市場上乳品中抗生素殘留情況，采用本研究建立的檢測方法對市售的50 種不同乳品進行了檢測，并對數(shù)據(jù)結(jié)果進行系統(tǒng)分析。50 個樣品中，其中一個樣品檢出氯霉素（如圖1 所示），含量為0.48 μg／kg。1999 年9 月13 日中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》［9］的通知，規(guī)定了氯霉素在所有食品動物的可食用組織中不得檢出，但檢測結(jié)果表明，中國市場上銷售的乳品氯霉素污染的風險仍然存在。

圖1 某氯霉素（0.48 μg／kg）陽性樣品的質(zhì)量色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of a positive sample containing chloramphenicol （0.48 μg／kg）

3 結(jié)論

本研究建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法實現(xiàn)了牛奶中35 種四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素殘留的測定。該方法簡單、快捷、經(jīng)濟，可實現(xiàn)多種抗生素殘留的快速測定，為我國執(zhí)法部門對乳品市場的監(jiān)管和質(zhì)量控制提供了有利的技術支持，該方法的推廣將為乳品質(zhì)量安全的監(jiān)督檢驗工作節(jié)省大量的人力物力資源和時間。

［1］ Takagi R，F(xiàn)ukuda J，Nagata K，et al. Analyst，2013，138（4）：1000

［2］ Huet A C，Charlier C，Tittlemier S A，et al. J Agric Food Chem，2006，54（8）：2822

［3］ Luzardo O P，Ruiz-Suarez N，Almeida-Gonzalez M，et al.Anal Bioanal Chem，2013，405（29）：9523

［4］ Wang H，Zhao L，Yang H，et al. Anal Methods，2014，6（5）：1545

［5］ Wang H，Zhou X J，Liu Y Q，et al. J Agric Food Chem，2011，59（8）：3532

［6］ Du J，Zhao H X，Chen J W. Chinese Journal of Chromatography （杜鵑，趙洪霞，陳景文. 色譜），2015，33（4）：348

［7］ Zhang X Y，Cai X X. Chinese Journal of Chromatography（張秀堯，蔡欣欣. 色譜），2014，32（7）：693

［8］ Li A M，Huang Z，Lu W P，et al. Chinese Journal of Chromatography （李愛梅，黃茁，盧文平，等. 色譜），2014，32（8）：897

［9］ Bulletin No. 235，Ministry of Agriculture of the People’s Republic China （中華人民共和國公告第235 號）. （2002-12-24）. http：／／ www. moa. gov. cn／zwllm／tzgg／gg／200302／t20030226_59300.htm