朱萬燕 ， 張 欣， 楊 娟， 徐文遠(yuǎn)， 許美玲

（臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 臨沂276034）

由于各類獸藥的理化性質(zhì)存在較大差異，現(xiàn)有的獸藥殘留分析主要以分類檢測(cè)為主［1，2］；這些方法所能同時(shí)分析的藥物種類較少，若要檢測(cè)多類獸藥，需進(jìn)行多次的樣品前處理，檢測(cè)周期長，成本高，效率低，不能滿足目前獸藥種類不斷增加、分析通量不斷提高的需求。因此獸藥多殘留同時(shí)檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)［3-7］。開發(fā)動(dòng)物源性食品中多類獸藥殘留同時(shí)分析的方法十分必要。

高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLCQ-TOF MS）分辨率高，可對(duì)化合物進(jìn)行精確分子質(zhì)量的測(cè)定，可以精確測(cè)定小數(shù)點(diǎn)后4 位有效數(shù)字，并依據(jù)所測(cè)得的化合物的精確分子質(zhì)量對(duì)其進(jìn)行確證分析；同時(shí)在碰撞誘導(dǎo)解離（CID）模式下，得到化合物碎片離子的分子式和精確分子質(zhì)量，可進(jìn)一步對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律加以確證，定性準(zhǔn)確性很高［8］。劉暢等［9］建立了豬肉中31 種β-受體激動(dòng)劑的HPLC-Q-TOF MS 同時(shí)測(cè)定方法；彭麗等［10］建立了超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLCQ-TOF MS）篩查牛奶中55 種藥物的方法；高馥碟等［11］建立了UPLC-Q-TOF MS 快速篩查牛奶中13種農(nóng)藥和29 種獸藥殘留的方法。目前，有關(guān)豬肉中6 類（磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類）33 種獸藥殘留的UPLC-QTOF MS 方法鮮有報(bào)道。

QuEChERS 方法［12］是固相萃取技術(shù)（SPE）和基質(zhì)固相分散技術(shù)（MSPD）的衍生和進(jìn)一步發(fā)展，該方法快速、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)，目前主要用于果蔬中農(nóng)藥殘留的分析，在動(dòng)物性食品檢測(cè)中的應(yīng)用較少［13，14］。

本文在確定的儀器條件下，建立了6 類33 種獸藥基于精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間和碎片離子信息的篩查數(shù)據(jù)譜庫（每種獸藥有在4 個(gè)不同碰撞能量下得到的碎片離子信息），并結(jié)合本文建立的QuECh-ERS／UPLC-Q-TOF MS 分析方法，實(shí)現(xiàn)了在無標(biāo)準(zhǔn)品的情況下對(duì)豬肉樣品中33 種獸藥進(jìn)行高選擇性的同時(shí)快速篩查和確認(rèn)，還可以對(duì)檢測(cè)到的目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290-6530 超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI 公司）；ULTRA-TURRAX T25 型均質(zhì)器、GENIUS 3 基本型渦流混勻器、HS260 型調(diào)速多用振蕩器（德國IKA 公司）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度：92.2% ～99.5%）均購自德國Dr. Ehrenstorfer 公 司；乙 腈（ACN）、甲 醇（MeOH）、乙酸乙酯（EtAc）、甲酸和乙酸（HAc）為色譜純，均購自美國Tedia 公司；硫酸鎂、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、硫酸鈉（Na2SO4）和氯化鈉（NaCl）為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C18、PSA（硅膠表面鍵合N-丙基乙二胺）、NH2、中性Al2O3、PAX（陰離子交換混合機(jī)理水可浸潤型聚合物基質(zhì)）、PCX（陽離子交換混合機(jī)理的水可浸潤型聚合物）、PEP（硅膠表面鍵合聚苯乙烯／二乙烯苯，表面同時(shí)具有親水性和憎水性基團(tuán)）、GCB（石墨化炭黑）、弗羅里硅土吸附劑均購于天津Bonna-Agela 公司；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore 純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）制得的高純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于25 mg 目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 燒杯中，用甲醇溶解并定量于25 mL容量瓶中，即得1 g／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃下避光保存。實(shí)驗(yàn)中用空白樣品提取液逐級(jí)稀釋，根據(jù)每種目標(biāo)化合物的定量限配制成不同濃度的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

提取：稱取4.0 g（精確至0.01 g）肉類樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 5% （v／v）乙酸乙腈溶液和0.1 g Na2EDTA，同時(shí)加入4.0 g 無水硫酸鈉和2.0 g 氯化鈉均質(zhì)提取1 min，于9 000 r／min 下離心5 min，取上清液待凈化。

凈化：將上清液移入裝有300 mg C18 和400 mg NH2吸附劑的50 mL 具塞離心管中，使吸附劑和提取液充分接觸，振蕩5 min，以9 000 r／min 冷凍（-2 ℃）離心5 min，靜置10 min 后，取10 mL 上清液（相當(dāng)于2.0 g 樣品）于50 mL 雞心瓶中，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮吹吹干。加入1 mL 0.1% （v／v）甲酸水-乙腈（9 ∶1，v／v）的定容液，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，濾液供UPLC-Q-TOF MS 測(cè)定。

1.4 儀器工作條件

UPLC 條件：ZORBAX SB-C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）。流動(dòng)相A 為乙腈，B 為0.1%（v／v）甲酸水溶液（含5 mmol／L 乙酸銨）；流速0.4 mL／min。梯度洗脫程序：0 ～10 min，1% A ～30%A；10 ～12 min，30% A ～40% A；12 ～14 min，40%A；14 ～14.1 min，40% A ～100% A；14.1 ～22 min，100% A；22 ～22.1 min，100% A ～1% A。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

Q-TOF MS 條件：電噴霧離子（ESI）源，正離子模式；毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化氣壓力2.4×105Pa；干燥氣溫度325 ℃；干燥氣流速10 L／min；鞘氣溫度325 ℃；鞘氣流速11 L／min；參比離子為m／z 121.050 9 和922.009 8，用于實(shí)時(shí)校正；數(shù)據(jù)采集采用棒狀圖數(shù)據(jù)采集模式，掃描范圍為m／z 50 ～1 700，掃描速率為3 spectra／s；產(chǎn)物離子數(shù)據(jù)在Target MS／MS 模式下設(shè)置固定的保留時(shí)間、母離子、碰撞能量等信息進(jìn)行采集，數(shù)據(jù)采集與處理使用Agilent MassHunter Workstation Software（version B.04.00），包括數(shù)據(jù)采集、定性分析、定量分析軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

［7］，選取0.1% （v／v）甲酸水（含5 mmol／L 的乙酸銨）和乙腈作為流動(dòng)相。本文所分析的33 種獸藥以極性化合物為主，色譜峰出峰相對(duì)集中且出峰時(shí)間較早，對(duì)于前10 min 的梯度洗脫程序，需要緩慢增加乙腈的比例，保證極性化合物的分離；10 min 之后，只有少量化合物出現(xiàn)在這一區(qū)域，此階段快速提高乙腈的比例可快速洗脫目標(biāo)化合物，縮短檢測(cè)時(shí)間。經(jīng)過流動(dòng)相梯度配比優(yōu)化使得不同種類的獸藥得到分離。目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖（TIC）見圖1。

圖1 33 種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of a mixed standard solution of the 33 veterinary drugs

2.2 數(shù)據(jù)庫的建立

配制1 000 μg／L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在LC-Q-TOF MS 全掃描模式下進(jìn)行測(cè)定，記錄化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量和保留時(shí)間；在Targeted MS／MS 采集界面輸入目標(biāo)物的母離子、保留時(shí)間和相應(yīng)的碰撞能量，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，選擇碎片離子信息較為豐富的4 個(gè)碰撞能量下的質(zhì)譜圖，并導(dǎo)出CEF 文件，將CEF 文件導(dǎo)入PCDL 軟件中，與對(duì)應(yīng)的獸藥信息相關(guān)聯(lián)并保存，即得數(shù)據(jù)譜庫。表1 列出了33種化合物的分子式、理論相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間和特征離子。

表1 33 種獸藥的保留時(shí)間、理論相對(duì)分子質(zhì)量和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times，theoretical relative molecular masses （Mr）and MS parameters for the 33 veterinary drugs

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

根據(jù)歐盟2002／657／EC 決議要求，當(dāng)使用高分辨質(zhì)譜作為確證技術(shù)時(shí)，檢測(cè)到1 個(gè)具有精確質(zhì)量數(shù)的母離子就獲得2 個(gè)確證分?jǐn)?shù)，二級(jí)質(zhì)譜中的每個(gè)子離子獲得2.5 個(gè)確證分?jǐn)?shù)，即1 個(gè)具有精確質(zhì)量數(shù)的母離子和1 個(gè)特征碎片離子便可獲得超過4分的確證分?jǐn)?shù)。經(jīng)1.3 節(jié)樣品前處理后，結(jié)合本文建立的數(shù)據(jù)庫，33 種獸藥化合物均能夠被四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜有效篩查出來。

2.3 檢索參數(shù)的優(yōu)化

篩查參數(shù)包括質(zhì)量偏差窗口、保留時(shí)間窗口等。合適的參數(shù)設(shè)置可以避免假陽性和假陰性結(jié)果，提高篩查方法的準(zhǔn)確性。

質(zhì)量偏差窗口的確定：在LOQ、2LOQ 和4LOQ 3 個(gè)添加水平下，對(duì)樣品中目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)偏差進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，84.8% 的目標(biāo)化合物的質(zhì)量偏差低于5×10-6（5 ppm），所有化合物的質(zhì)量偏差均低于10×10-6（10 ppm）（見圖2）。

圖2 33 種獸藥在3 個(gè)添加水平下的質(zhì)量偏差分布Fig.2 Distributions of Mr error for the 33 veterinary drugs at three spiked levels

保留時(shí)間窗口的確定：在樣品基質(zhì)中進(jìn)行保留時(shí)間限定參數(shù)的評(píng)估，保留時(shí)間的限定范圍分別為0.10、0.25、0.50、1.00 min 和無保留時(shí)間限定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在保留時(shí)間限定為0.10、1.00 min 和無保留時(shí)間限定的條件下，待測(cè)化合物出現(xiàn)定性偏差的占比分別為8.3%、2.5% 和16.7%；保留時(shí)間限定為0.25、0.50 min 時(shí)，所有待測(cè)化合物均未出現(xiàn)定性偏差；此外，實(shí)驗(yàn)通過目標(biāo)化合物保留時(shí)間的重復(fù)性（n ＝6）和重現(xiàn)性（n ＝6），對(duì)保留時(shí)間的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，結(jié)果表明日內(nèi)保留時(shí)間最大標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.14 min，日間保留時(shí)間最大標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.24 min。最終保留時(shí)間的限定參數(shù)被設(shè)置為0.25 min。

2.4 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.4.1 鹽析劑和吸水劑的選擇

對(duì)于水果蔬菜樣品，QuEChERS 前處理普遍采用NaCl 作為鹽析劑，MgSO4作為吸水劑。由于本方法沒有添加水，NaCl 在本方法中的作用主要是輔助細(xì)胞破碎和目標(biāo)物溶出，將樣品中的少量水分析出，從而有利于吸水劑吸附。在QuEChERS 方法中添加MgSO4，主要是由于MgSO4能夠吸收大量的水分。實(shí)驗(yàn)表明MgSO4作為吸水劑會(huì)明顯降低部分獸藥如磺胺類、喹諾酮類及四環(huán)素類的回收率，特別是四環(huán)素類藥物。這是由于MgSO4中的Mg2＋和四環(huán)素類獸藥結(jié)合形成配合物，從而影響了四環(huán)素類獸藥的提取，因此，實(shí)驗(yàn)選擇Na2SO4替代MgSO4作為吸水劑。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了NaCl 和Na2SO4的用量，當(dāng)添加2 g NaCl 和4 g Na2SO4時(shí)，兩相分離效果最好，獲得了較高的回收率。此外，為了抑制四環(huán)素類獸藥與陽離子的配合作用，在提取液中加入0.1 g Na2EDTA。

2.4.2 提取劑的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)獸藥殘留檢測(cè)常用提取試劑（乙腈、5%（v／v）乙酸乙腈、乙酸乙酯、甲醇）的提取效率進(jìn)行了比較。從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象看，用乙腈、乙酸乙酯和乙酸乙腈提取時(shí)，提取液澄清；用甲醇提取時(shí)，提取液渾濁，這可能是由于甲醇與蛋白質(zhì)形成絮狀沉淀的原因，不利于后續(xù)凈化和測(cè)定步驟的進(jìn)行。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，乙酸乙腈的提取效率最高，75.7% 的目標(biāo)化合物的回收率在70% ～120% 范圍內(nèi)，且采用乙酸乙腈提取時(shí)，共提物較少，初步確定采用乙酸乙腈作為提取液。不同提取劑對(duì)33 種目標(biāo)物平均回收率的影響見圖3。

圖3 不同提取劑對(duì)33 種目標(biāo)物平均回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on the average recoveries of the 33 analytes

對(duì)乙酸乙腈的酸度進(jìn)行了優(yōu)化，比較了1%、3%、5%、7%、10%、15% （v／v）乙酸乙腈的提取效率。結(jié)果顯示，采用5% 和7% 乙酸乙腈提取時(shí)，回收率沒有明顯區(qū)別，提取效率最高，最終確定5%（v／v）乙酸乙腈為本方法的提取劑。

對(duì)提取劑的體積進(jìn)行了優(yōu)化，比較了不同體積（8、12、16、20、24、28 mL）乙酸乙腈的提取效率。結(jié)果表明，體積低于20 mL 時(shí)，隨著提取溶劑體積的增加，回收率增大，當(dāng)體積為20 mL 時(shí)，目標(biāo)化合物的平均回收率最高為85.7%；隨著提取劑體積的繼續(xù)增加，共萃取干擾物增多，回收率呈降低趨勢(shì)，因此最終選擇20 mL 為本方法的提取劑體積。

2.4.3 吸附劑的優(yōu)化

比較了C18、PSA、PAX、NH2、PEP 吸附劑及兩兩組合對(duì)提取液的凈化效果及對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。C18 主要吸附非極性物質(zhì)，對(duì)脂肪等共提物吸附性強(qiáng)，而NH2對(duì)糖類共提物凈化效果好。從回收率角度看，C18、NH2兩種吸附劑單獨(dú)使用時(shí)，目標(biāo)化合物的平均回收率分別為80.6% 和70.3%；當(dāng)將200 mg C18 與200 mg NH2兩種吸附劑組合使用時(shí)目標(biāo)物的平均回收率為89.3%。表明兩者混合使用時(shí)凈化效果好于兩者單獨(dú)使用時(shí)的凈化效果。因此最終確定吸附劑為C18 和NH2。不同吸附劑對(duì)33 種目標(biāo)物平均回收率的影響見圖4。

圖4 不同吸附劑對(duì)33 種目標(biāo)物平均回收率的影響Fig.4 Effect of different sorbents on the average recoveries of the 33 analytes

對(duì)吸附劑的用量進(jìn)行了優(yōu)化，考察了50 ～600 mg C18 與50 ～600 mg NH2按不同比例組合的凈化效果及對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明，300 mg C18 與400 mg NH2組合時(shí)凈化效果最好，回收率在70% ～120% 之間的目標(biāo)化合物占比為90.9%，回收率在60% ～120% 之間的目標(biāo)化合物占比為93.9%。因此最終確定C18 與NH2吸附劑的用量分別為300 mg 與400 mg。

2.5 方法考察

2.5.1 基質(zhì)效應(yīng)

通過比較空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值的差異評(píng)價(jià)方法的基質(zhì)效應(yīng)。參照文獻(xiàn)［15］，在空白基質(zhì)提取液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與相同濃度純?nèi)軇┗旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的信號(hào)強(qiáng)度（峰面積）相比，當(dāng)比值等于或接近1 時(shí)（在0.85 ～1.15 范圍內(nèi)），認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯；小于0.85 時(shí)，表明存在明顯的離子抑制作用，大于1.15 時(shí)表明存在明顯離子增強(qiáng)作用。結(jié)果見圖5，可見在豬肉樣品基質(zhì)中有63.6% 的目標(biāo)化合物基質(zhì)效應(yīng)不明顯，其余目標(biāo)化合物都不同程度地存在離子抑制或離子增強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。為盡可能地消除基質(zhì)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配法進(jìn)行定量分析。

圖5 豬肉樣品基質(zhì)中目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)分布Fig.5 Distribution of matrix effect of the analytes in pork

2.5.2 方法的線性關(guān)系和定量限

取空白樣品，按1.3 節(jié)方法進(jìn)行提取、凈化、定容得到樣品提取液，根據(jù)目標(biāo)化合物在質(zhì)譜中響應(yīng)的強(qiáng)弱，加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以準(zhǔn)分子離子的峰面積Y 對(duì)含量X 做標(biāo)準(zhǔn)曲線，33 種目標(biāo)化合物的線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。用空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，直到獲得每種目標(biāo)化合物的信噪比等于10（S／N＝10）的濃度，確定其為該化合物的定量限（LOQ）。

如表2 所示，33 種目標(biāo)化合物在各自的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.99，LOQ 為2.5 ～100 μg／kg。對(duì)于大多數(shù)有最大殘留限量（MRL）規(guī)定的獸藥來講，該方法的LOQ 小于MRL，可以滿足快速篩查的需要。

表2 33 種目標(biāo)化合物的線性關(guān)系和定量限Table 2 Linear relationships and limits of quantification of the 33 compounds

2.5.3 方法的回收率和精密度

在經(jīng)測(cè)定不含有待測(cè)物質(zhì)的豬肉樣品中進(jìn)行5個(gè)加標(biāo)水平（LOQ、2LOQ、4LOQ、500 μg／kg 和1 000 μg／kg）的回收率和精密度測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平做6 個(gè)平行樣，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，33 種化合物的回收率在67.0%～109.0% 范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于15.1%（表略），表明方法回收率高、通用性強(qiáng)，可以滿足日常豬肉樣品中33 種獸藥殘留的同時(shí)測(cè)定。

2.6 方法應(yīng)用

應(yīng)用本方法對(duì)30 件從市場(chǎng)購買的豬肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一件豬肉樣品中檢出土霉素，含量為90.5 μg／kg。為了驗(yàn)證該結(jié)果，我們采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB／T 21317-2007《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜法與高效液相色譜法》中的液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜法，對(duì)上述檢出的陽性樣品進(jìn)行了確證，檢測(cè)結(jié)果為土霉素97.0 μg／kg，與本文方法的測(cè)定結(jié)果相吻合。

3 結(jié)論

本文利用QuEChERS 方法提取、凈化，結(jié)合高分辨的超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，建立了豬肉中6 類33 種獸藥殘留的檢測(cè)方法。該方法快速、簡便、靈敏，可以對(duì)樣品中的目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析，適用于豬肉樣品中多類獸藥殘留的快速檢測(cè)。

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