亓偉梅， 趙先恩 ， 亓 永， 孫志偉， 陳 光， 尤進(jìn)茂，* ， 索有瑞

（1. 萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工教研室，山東 萊蕪271100；2. 山東省生命有機(jī)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省高校綠色天然產(chǎn)物與醫(yī)藥中間體重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東 曲阜273165；3. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧810001）

左旋多巴（L-dihydroxyphenylalanine，LDOPA）是多巴胺（dopamine，DA）體內(nèi)合成的前體物質(zhì)，主要通過血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)入腦，經(jīng)體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為藥效成分DA，從而發(fā)揮其“替代療法”作用，是目前臨床方面改善帕金森?。≒D）癥狀最有效的藥物之一。但是，長期使用L-DOPA 療效會降低且會給病人帶來嚴(yán)重的副作用，包括癥狀波動、運(yùn)動障礙、開-關(guān)反應(yīng)及精神癥狀等，給PD 中晚期的治療帶來嚴(yán)重的困難。已有研究報道L-DOPA 副作用的產(chǎn)生與其腦內(nèi)濃度、所轉(zhuǎn)化的DA 濃度波動具有密切相關(guān)性［1-3］。因此，同時監(jiān)測腦內(nèi)L-DOPA 和DA濃度的動態(tài)變化，能夠?yàn)樘岣週-DOPA 對PD 的臨床療效以及藥物篩選提供重要依據(jù)。

已報道的L-DOPA 和DA 的檢測方法有熒光光度法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法、HPLC、CE、LC-MS等［4-6］。因?yàn)槟X微透析液樣本量少、L-DOPA 和DA含量低且基質(zhì)復(fù)雜，直接檢測時熒光或質(zhì)譜響應(yīng)信號弱。衍生化LC-MS／MS 法因其選擇性、靈敏度、抗基質(zhì)干擾、多成分同時檢測等優(yōu)勢成為一類重要方法［4，7-10］。最近，穩(wěn)定同位素衍生化LC-MS／MS法相繼被報道，結(jié)果表明其具有較好的靈敏度和抗基質(zhì)干擾能力［11-15］。同時，超聲輔助-分散液液微萃?。╱ltrasonic-assisted dispersive liquid-liquid microextraction，UA-DLLME）聯(lián)合衍生化的樣品前處理技術(shù)已在分析化學(xué)的交叉學(xué)科研究中展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢［16-19］。

本文采用d0／d3-10-甲基-吖啶酮-2-磺酰氯（d0／d3-MASC）作為穩(wěn)定同位素衍生化試劑［13］，聯(lián)合UA-DLLME 技術(shù)，建立并驗(yàn)證了帕金森病大鼠腦微透析液中L-DOPA 和DA 的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UHPLC-MS／MS）檢測方法，為左旋多巴的臨床療效及減毒增效藥物篩選提供了一種良好的技術(shù)手段，具有活體、連續(xù)、靈敏、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

美國Waters Xevo TQ 三重四極桿質(zhì)譜儀（Waters公司）；瑞典CMA 微透析取樣系統(tǒng)，包括CMA 402 雙通道微透析泵、MAB85 雙通道冷卻收集器、MAB6 腦探針及導(dǎo)引管，以及動物五通道清醒活動裝置（美國Instech 公司）；動物手術(shù)設(shè)備：CMA450 動物體溫控制器、美國ASI SAS-4100 單臂腦立體定位儀、顱鉆（深圳沃瑞德科技有限公司）；BS l10S 分析天平（北京賽多利斯有限公司）；Milli-Q 超純水儀；Eppendorf 5810R 高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）；XW-80A 漩渦混勻器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；雷茲pH 計。

L-DOPA 和DA（Sigma 公司）；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純（Sigma 公司）；碳酸鈉、碳酸氫鈉等為分析純；同位素衍生化試劑d0／d3-MASC（純度99%）自主合成［13］；水為Millipore 純水系統(tǒng)制備。

1.2 溶液配制

按實(shí)驗(yàn)要求稱取適量d0／d3-MASC，用乙腈配成1.0×10-3mol／L 的溶液。分別稱取適量L-DOPA和DA 標(biāo)準(zhǔn)品，用50% （v／v）乙腈水溶液配成0.01 mol／L 儲備液，稀釋 得系 列 工 作 液。Na2CO3-NaHCO3緩沖 液（0.1 mol／L）經(jīng) 純 水 配 制 后 用NaOH 溶液精密調(diào)節(jié)pH 至10.8。

1.3 活體大鼠腦微透析取樣及動物分組

雄性SD 大鼠（200 ～220 g），購自山東魯抗醫(yī)藥有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心，動物手術(shù)、PD 動物模型和微透析探針手術(shù)技術(shù)按照王丹巧研究組［3］報道的方法開展實(shí)驗(yàn)，腦內(nèi)注射6-羥基多巴胺（6-OHDA）造模，分為正常組、PD 模型組、PD ＋L-DOPA組、PD＋L-DOPA＋首烏方高劑量組（PD＋L-DOPA＋high SWF，生藥量18 g／（kg·d））、PD＋L-DOPA＋首烏方低劑量組（PD＋L-DOPA＋low SWF，生藥量8 g／（kg·d）），每組6 只。微透析灌 流 速 度2.0 μL／min，平衡60 min 后開始收集透析液，每15 min自動收集1 管用于后續(xù)檢測。

1.4 同位素編碼衍生

在1.5 mL 離心管中加入100 μL d0-MASC 溶液、適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（或大鼠腦微透析液樣本，20～50 μL）、100 μL Na2CO3-NaHCO3緩沖液，混勻后37 ℃下恒溫衍生反應(yīng)3.0 min 即可完全標(biāo)記，加入10 μL 25% （v／v）甲酸水溶液調(diào)pH 至弱酸性。在第二支離心管中，采取同樣的方式，用d3-MASC 標(biāo)記另一份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液或微透析液樣品，標(biāo)記流程示意圖見圖1。

圖1 L-DOPA 和DA 的穩(wěn)定同位素編碼衍生和分散液液微萃取示意圖Fig.1 Procedure scheme of stable isotope-coded derivatization and dispersive liquid-liquid microextraction of L-DOPA and DA

1.5 超聲輔助-分散液液微萃取

將上述兩支離心管中的標(biāo)記產(chǎn)物合并至一支10 mL 尖底離心管中，加水至8 mL，以400 μL 甲醇為分散劑，160 μL 氯仿為萃取劑，室溫下超聲振蕩萃取3.0 min，10 000 r／min高速離心3.0 min，吸取下層有機(jī)相，氮吹至干，50% （v／v）甲醇水復(fù)溶后用于檢測。

1.6 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為UPLC BEH Shield RP 18 柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters 公司）。流動相A 為甲醇，流動相B 為0.1% （v／v）甲酸水溶液。梯度洗脫條件：0 ～2.0 min，65% A ～100% A。流速0.5 mL／min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。采用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，電噴霧電離（ESI）源正離子模式，離子源溫度150 ℃，毛細(xì)管電壓3.0 kV，脫溶劑氣（氮?dú)猓┝魉?00 L／h、溫度350℃，錐孔氣（氮?dú)猓┝魉?0 L／h，碰撞氣（氦氣）流速0.16 mL／min，錐孔電壓、碰撞能、定量和定性離子對參數(shù)見表1。

表1 L-DOPA 和DA 的d0／d3-MASC 衍生物的質(zhì)譜MRM 采集參數(shù)Table 1 Conditions of d0／d3-MASC derivatives of L-DOPA and DA in mass spectrometric MRM analysis

1.7 定量方式

參考許國旺研究組［20］和本研究組［15］的同位素編碼標(biāo)記定量法：兩份等濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用d0-MASC 和d3-MASC 標(biāo)記，將兩份衍生溶液按體積比1／10、1／5、1／2、1／1、2／1、5／1、10／1 混合之后進(jìn)行UHPLC-MS／MS 分析，以輕／重衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜峰面積比值對體積比值進(jìn)行線性回歸曲線制作，獲得輕／重衍生物的相對響應(yīng)因子。微透析液和適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)輕／重編碼標(biāo)記后，按一定比例混合之后進(jìn)行UHPLC-MS／MS 分析，利用相對響應(yīng)因子計算微透析液中兩種分析物的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

L-DOPA 和DA 分子本身極性強(qiáng)，采用直接LCMS 檢測時色譜保留弱、分離度較差，采用本研究實(shí)驗(yàn)部分梯度洗脫條件時，二者的保留時間均小于0.5 min。采用MASC 衍生化技術(shù)，能夠顯著改善二者在反相色譜柱上的保留行為。經(jīng)優(yōu)化不同色譜柱（Agilent 公司的Eclipse、Zorbax 系列的50、100 mm 長的超高效液相色譜柱，以及Waters BEH 系列的50 mm 超高效液相色譜柱）和流動相條件（甲醇、乙腈、水相是否有甲酸調(diào)節(jié)劑），發(fā)現(xiàn)酸性的甲醇／水體系配合Waters UPLC BEH Shield RP 18 超高效液相色譜柱有較好的分離效果。如要在1.0 min 左右完成分離檢測，兩種分析物的峰形、分離度欠佳，影響定量準(zhǔn)確度。進(jìn)一步優(yōu)化梯度洗脫程序，當(dāng)采用1.6 節(jié)中梯度洗脫程序時，L-DOPA 和DA衍生物在2.0 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了完全分離，峰形良好，保留時間見表1。經(jīng)實(shí)驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn)，正離子模式的靈敏度顯著高于負(fù)離子模式。在正離子模式下，發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管電壓在1.2 ～3.0 kV 內(nèi)逐漸增加時檢測信號逐漸增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)選用3.0 kV。質(zhì)譜儀脫溶劑氣流速和溫度影響不明顯，采用脫溶劑氣流速800 L／h、溫度350 ℃能獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用實(shí)驗(yàn)部分的質(zhì)譜條件，優(yōu)化了兩種衍生產(chǎn)物的MRM 參數(shù)（見表1）。L-DOPA 和DA 衍生物都能特異性地產(chǎn)生208.10 Da （重標(biāo)211.10 Da）的產(chǎn)物離子，在酸性乙腈／水流動相體系中，該產(chǎn)物離子結(jié)構(gòu)通過酮式-烯醇式互變，極易產(chǎn)生帶一個正電荷的季銨型結(jié)構(gòu)，因此產(chǎn)生L-DOPA 和DA 吖啶酮衍生物的質(zhì)譜增敏結(jié)果。代表性的d0-MASC-L-DOPA 衍生物的MS／MS 圖、裂解模式及質(zhì)譜增敏產(chǎn)物離子見圖2。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

采用MASC 試劑標(biāo)記L-DOPA 和DA 分子中的氨基和酚羥基，該衍生化反應(yīng)的主要影響因素包括緩沖溶液pH、衍生化溫度、時間、衍生化試劑倍數(shù)。參照以往MASC 衍生化環(huán)境雌激素分子中酚羥基基團(tuán)的方法與條件［13］進(jìn)行單因素法優(yōu)化。首先考察緩沖液pH 在8.0 ～11.0 范圍內(nèi)對衍生反應(yīng)的影響，pH 8.0 ～9.0 時目標(biāo)衍生化產(chǎn)物的儀器信號極低；pH＞9.0 時信號隨pH 增大而逐漸提高；pH 10.8時達(dá)到最大值，之后儀器信號下降，這可能是因?yàn)閺?qiáng)堿性導(dǎo)致衍生試劑和衍生物的分解更甚。因此實(shí)驗(yàn)選用pH 10.8 的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。同樣考察MASC 用量、衍生時間、溫度變化規(guī)律。隨MASC用量增加，衍生物的儀器信號逐漸增大；當(dāng)MASC用量為兩種分析物總物質(zhì)的量的8 倍時儀器信號最高。在衍生時間和溫度方面，37 ℃下衍生3 min 產(chǎn)物的信號最大?？傊?，實(shí)驗(yàn)最佳衍生化條件為：Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 10.8），37 ℃下衍生反應(yīng)3 min，MASC 物質(zhì)的量為兩種分析物總量的8 倍。

圖2 d0-MASC-L-DOPA 的MS／MS 圖、特異性產(chǎn)物離子裂解模式及MS 增敏機(jī)理Fig.2 MS／MS spectrum，specific fragmentation scheme and MS sensitivity enhancement mechanism of d0-MASC-L-DOPA

2.3 UA-DLLME 條件的優(yōu)化

UA-DLLME 實(shí)驗(yàn)的主要影響因素包括萃取劑、分散劑的種類、用量以及超聲時間。經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，萃取劑、分散劑的種類和用量是影響萃取效率的最重要因素。選取5 種萃取劑（氯苯、二氯乙烷、四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷）和4 種分散劑（甲醇、乙醇、乙腈、丙酮）進(jìn)行分別交叉組合考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三氯甲烷作為萃取劑、甲醇作為分散劑時，不但易于離心分層，而且沉積相中萃取物的儀器響應(yīng)信號最高，且分析方法回收率較好。因此，實(shí)驗(yàn)選擇三氯甲烷作為萃取劑，甲醇作分散劑?？疾燧腿┖头稚┑挠昧?，當(dāng)三氯甲烷160 μL、甲醇400 μL 時，沉積相中萃取物的儀器信號響應(yīng)值最高。采用以上最佳條件進(jìn)行超聲萃取時間的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)超聲振蕩3.0 min 可獲得最高的儀器響應(yīng)值。采用以上優(yōu)化條件進(jìn)行一次UA-DLLME 后，吸凈下層沉積相，再對上層溶液重復(fù)進(jìn)行一次UA-DLLME 和檢測，未檢出L-DOPA 和DA 衍生物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立的UA-DLLME 條件對L-DOPA 和DA 衍生物的萃取效率滿足分析方法要求。

2.4 分析方法的評價

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

采用優(yōu)化的衍生化、UA-DLLME 和色譜-質(zhì)譜分析條件及定量方式，在0.20 ～1 500.0 nmol／L 濃度范圍內(nèi)進(jìn)行線性回歸曲線制作，L-DOPA和DA 衍生物的線性回歸系數(shù)大于0.994，線性關(guān)系良好。L-DOPA、DA 的檢出限（S／N ＝3）分別為0.005、0.009 nmol／L，定量限（S／N ＝10）分別為0.020、0.036 nmol／L。

2.4.2 穩(wěn)定性、精密度和準(zhǔn)確度

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，在PD 癥大鼠腦微透析液中加標(biāo)濃度分別為0.10、10.0 nmol／L 時制備MASC 的衍生物，用于穩(wěn)定性、精密度及準(zhǔn)確度的考察。上述兩個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)MASC 衍生化產(chǎn)物溶液在室溫下放置7 天，分別于第1、3、5、7 天測定峰面積，計算峰面積的RSD，在4.1% ～8.9%之間，表明L-DOPA 和DA 的MASC 衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性良好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。同一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次、連續(xù)3 日每日進(jìn)樣5 次分別用于日內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度的考察，峰面積的RSD 為3.0% ～9.1%，精密度良好；添加物的檢出濃度和理論濃度比值在89.5% ～104.9% 之間，準(zhǔn)確度良好。

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)和回收率

考察PD 癥大鼠腦微透析液在0.10、10.0 nmol／L 加標(biāo)水平下的回收率，結(jié)果為94.8% ～103.8% ，表明方法回收率良好。按照（微透析液中添加的L-DOPA 或DA 質(zhì)譜檢測峰面積／純水中等量添加物峰面積）×100% 計算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果為97.5%～103.8% ，表明同位素編碼衍生化與DLLME 聯(lián)合使用的方法具有良好的抗基質(zhì)干擾能力。

2.5 方法比較

用本方法與神經(jīng)遞質(zhì)分析方法領(lǐng)域的代表性研究［7，10，20-22］進(jìn)行比較。第一，與2 種未經(jīng)衍生的代表性的直接檢測方法HPLC-電化學(xué)法［20］和親水作用色譜-質(zhì)譜（HILIC-MS／MS）［21］相比，本方法中兩種分析物的LOD 是其1／55 ～1／10 944 ，分析時間短10 或18 min。第二，與3 種典型的衍生化LCMS／MS 檢測方法相比，本方法的LOD 是文獻(xiàn)［7，10］的1／3 ～1／80，LOQ 是文獻(xiàn)［22］的1／1 265 ，而且本方法的衍生化反應(yīng)溫度適合生物樣本，衍生化時間縮短為原來的1／8 ～1／20，分離時間與文獻(xiàn)相當(dāng)［10，22］或更短［7］。第三，在基質(zhì)效應(yīng)方面，用本方法與不采用同位素編碼衍生技術(shù)（具體方法如下：只使用d0-MASC 衍生，UA-DLLME 和質(zhì)譜分析基本條件與本方法相同，定量方式采用文獻(xiàn)［17］中常規(guī)的外標(biāo)法）進(jìn)行對比，結(jié)果表明，本方法基質(zhì)效應(yīng)的平均值為98.9%、標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%，顯著優(yōu)于只用d0-MASC 衍生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（基質(zhì)效應(yīng)的平均值為94.6%、標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.8%），這說明同位素編碼衍生化聯(lián)合UA-DLLME 技術(shù)能夠顯著降低基質(zhì)干擾。

2.6 首烏方對PD 大鼠腦微透析液中L-DOPA 和DA 濃度的影響

王丹巧研究組［3］采用PD 大鼠模型考察了中藥方劑首烏方協(xié)同的L-DOPA 藥代動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)在以較小劑量L-DOPA 發(fā)揮較大藥效作用方面，中藥方劑首烏方具有良好的協(xié)同作用，但該報道未同時檢測DA 濃度受到的影響。本文利用該動物模型，進(jìn)一步考察高、低劑量的首烏方與L-DOPA 同時使用時對大鼠腦內(nèi)紋狀體L-DOPA 和DA 濃度的影響。按照實(shí)驗(yàn)部分的步驟，將采集得到的各組大鼠腦微透析液樣本按照本法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，PD 模型組大鼠紋狀體DA 含量顯著低于正常組（p＜0.01），從生化分析層面證明本研究PD 動物模型復(fù)制成功。表2 為3 組PD 癥大鼠給予西藥、中西藥結(jié)合（首烏方高、低劑量組）干預(yù)后的腦紋狀體L-DOPA和DA 的濃度結(jié)果。正常組、PD 模型組、PD ＋LDOPA＋首烏方高劑量組的大鼠腦微透析液樣品UHPLC-MS／MS （MRM）分析結(jié)果見圖3，峰形、分離度良好，未發(fā)現(xiàn)干擾物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與PD＋L-DOPA組相比，PD＋L-DOPA＋首烏方高、低劑量組紋狀體細(xì)胞外液中L-DOPA 和DA 二者的濃度達(dá)到的最大值更低，且時間滯后，而且可以穩(wěn)定紋狀體L-DOPA 藥物及活性成分DA 的濃度，使腦內(nèi)二者濃度較長時間維持在有效水平，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與首烏方高、低劑量具有相關(guān)性。這提示首烏方中的中藥成分可延緩L-DOPA 的代謝和消除，減小它們的濃度波動范圍，以提高L-DOPA 的療效，減少副作用，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)［3］中探討的首烏方協(xié)同LDOPA 治療PD 的機(jī)制相同。

表2 L-DOPA 和DA 在大鼠紋狀體微透析液中濃度的動態(tài)變化（n＝6）Table 2 Dynamic concentration changes of L-DOPA and DA in rat striatum microdialysate （n＝6）

圖3 大鼠腦微透析液中L-DOPA 和DA d0／d3-MASC 衍生物的UHPLC-MS／MS （MRM）色譜圖Fig.3 UHPLC-MS／MS （MRM）chromatograms of L-DOPA and DA derivatives of d0／d3-MASC in rat brain microdialysate

3 結(jié)論

建立并驗(yàn)證了同時測定L-DOPA 和DA 的穩(wěn)定同位素編碼衍生-分散液液微萃取UHPLC-MS／MS分析方法，該方法具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、專屬性強(qiáng)、抗基質(zhì)干擾等特點(diǎn)，能有效監(jiān)控不同組PD 大鼠腦微透析液中L-DOPA 藥物和生物活性成分DA 的含量，為PD 相關(guān)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和藥物篩選提供了一種技術(shù)手段。

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