鄭鵬磊， 羅智敏， 暢瑞苗， 葛燕輝， 杜 瑋， 常 春， 傅 強(qiáng)

（西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安710061）

1928 年，F(xiàn)leming 發(fā)現(xiàn)了青霉素，隨后青霉素一直廣泛應(yīng)用于臨床，挽救了無(wú)數(shù)人的生命。青霉素具有抗菌能力強(qiáng)、高效、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，然而其過敏反應(yīng)的發(fā)生率居各類藥物首位，被視為世界性醫(yī)學(xué)難題［1，2］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)致敏原并非青霉素藥物本身，而是在合成、儲(chǔ)存或使用過程中，在潮解、受熱、pH 變化或酶的作用下，青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)易于開環(huán)產(chǎn)生青霉噻唑酸（penicilloic acid，PEOA）及多聚物等雜質(zhì)［3］。青霉噻唑酸在體內(nèi)易與蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合形成全抗原，激發(fā)T 細(xì)胞，從而誘發(fā)過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致休克或死亡［4］。青霉素類抗生素被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，然而青霉素進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)肝臟代謝可產(chǎn)生青霉噻唑酸并在肝臟蓄積，食用此類動(dòng)物源食品對(duì)人們的身體健康具有潛在危害，嚴(yán)重影響食品的質(zhì)量和安全［5］。因此建立快速有效的青霉噻唑酸分離分析方法，對(duì)提高青霉素藥物的安全性、減少過敏反應(yīng)的發(fā)生和檢測(cè)食品中抗生素的殘留有重要意義。

目前已有報(bào)道的青霉噻唑酸分析方法有薄層色譜法［6］、高效液相色譜法［7，8］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［9，10］、酶聯(lián)免疫吸附法［11］等。此外，樣品的前處理技術(shù)對(duì)于復(fù)雜樣品的高靈敏度檢測(cè)尤為重要，傳統(tǒng)的前處理技術(shù)有液-液萃取、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）等，然而常用的萃取介質(zhì)如C8、C18 等存在特異性識(shí)別差、回收率低、內(nèi)源性雜質(zhì)干擾嚴(yán)重等問題，導(dǎo)致分析結(jié)果存在重復(fù)性差、專屬性不強(qiáng)和準(zhǔn)確度不高的問題。近年來(lái)，為了滿足高選擇性的需求，新的萃取介質(zhì)如分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）受到了廣泛關(guān)注［12-15］，分子印跡聚合物具有特異識(shí)別性、廣泛實(shí)用性和構(gòu)效預(yù)定性等優(yōu)點(diǎn)，將分子印跡聚合物用于固相萃取介質(zhì)可特異性識(shí)別復(fù)雜樣品中的目標(biāo)分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子及其結(jié)構(gòu)類似物的選擇性富集和分離。

分子印跡聚合物的制備方法主要有本體聚合法、沉淀聚合法和懸浮聚合法等，然而這些聚合方法存在模板分子難以洗脫、印跡位點(diǎn)包埋過深、吸附速率慢、結(jié)合容量低等缺點(diǎn)［16］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)以表面聚合法制備的聚合物具有特異的選擇性、更易接近的結(jié)合位點(diǎn)、快速的傳質(zhì)速率和較高的結(jié)合動(dòng)力學(xué)等優(yōu)點(diǎn)，表面聚合法已日益成為分子印跡領(lǐng)域的主要聚合技術(shù)［13，15，17］。

本研究采用表面印跡聚合法，以青霉噻唑酸為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，甲醇／乙腈為溶劑，在改性硅膠表面制備青霉噻唑酸分子印跡聚合物，并對(duì)模板分子-功能單體摩爾比、交聯(lián)度和溶劑等聚合條件進(jìn)行優(yōu)化。利用掃描電鏡、紅外光譜、元素分析和熱重分析對(duì)聚合物形貌和物理特性進(jìn)行表征。結(jié)合高效液相色譜法（HPLC），采用靜態(tài)吸附、吸附動(dòng)力學(xué)及選擇性吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)青霉噻唑酸分子印跡聚合物的吸附性能進(jìn)行考察。所制備的分子印跡聚合物用于固相萃?。∕ISPE），為建立青霉素類藥物和食品中致敏性雜質(zhì)青霉噻唑酸的分離分析方法奠定了基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)青霉素藥物的安全性評(píng)價(jià)和食品中青霉素殘留的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

青霉噻唑酸（按照已報(bào)道的合成方法［18，19］自制）；青霉素G（penicillin G，純度＞97%）、6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicilanic acid，純度＞99%）、美洛西林（mezloeillin，純度＞98%）、氯唑西林（cloxacillin，純度＞97%）、奧拉西坦（oxiracetam，純度＞94%）均購(gòu)于西安仁達(dá)生物科技有限公司；乙二酸二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA，美國(guó)Sigma 公司，分析純）使用前經(jīng)堿液萃??；甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA，天津市化學(xué)試劑研究所，分析純）使用前經(jīng)減壓蒸餾處理；偶氮二乙丁腈（2，2′-azobisisobutyronitrile，AIBN，上海試劑四廠，化學(xué)純）使用前經(jīng)甲醇重結(jié)晶；3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES，北京百靈威化學(xué)有限公司，化學(xué)純）；磷酸氫二銨、磷酸、鹽酸（北京化工廠）；硅膠（粒徑：100 μm，Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd，日本）；三蒸水（Molelement 1805b 元素型超純水機(jī)，上海摩勒生物科技）；其余試劑均為分析純或色譜純。

Shimadzu 色譜系統(tǒng)包括LC-20AT 泵、SPD-20A 紫外檢測(cè)器、CBM-102 實(shí)時(shí)分析色譜工作站；AUY220 型電 子天平（日本 Shimadzu 公 司）；Mettler Toledo pH 計(jì)（德國(guó)梅特勒-托利多集團(tuán)）；Thermo Nicolet Nexus 330 FT-IR Spectrometer（美國(guó)Madison 公司）；TM-1000 Scanning Microscope（日本Hitachi 公司）；EL3 Elementary Analyser （德國(guó)Elementar 公司）；SDT Q600 Thermogravimetric Analyzer （美 國(guó) TGA 公 司）；KQ3200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-2AB 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 HPLC 條件

色譜柱：Promosil C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-磷酸氫二銨溶液（0.05 mol／L，pH 6.18）（15 ∶85，v／v），過濾并超聲后使用；流速：0.8 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 青霉噻唑酸分子印跡聚合物的制備

采用表面印跡聚合法，以PEOA 為模板分子，MAA 為功能單體，EGDMA 為交聯(lián)劑，甲醇／乙腈為溶劑，在改性硅膠表面制備青霉噻唑酸分子印跡聚合物（PEOA-MIPs）。

1.3.1 硅膠的活化

稱取球形硅膠約6 g，分散于50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的HCl 溶液中，在110 ℃下加熱攪拌回流24 h，然后用大量水洗至中性，60 ℃下干燥24 h。

1.3.2 硅膠的改性

稱取活化硅膠約5 g 于100 mL 圓底燒瓶中，依次加入甲苯50 mL、APTES 2 mL 和三乙胺1 mL，110 ℃下加熱攪拌回流24 h。反應(yīng)后用甲醇洗去未反應(yīng)試劑，60 ℃下干燥24 h 即得改性硅膠（SiO2-APTES）。

1.3.3 PEOA-MIPs 的制備

稱取0.5 mmol PEOA 于10 mL 甲醇中，超聲溶解后加10 mL 乙腈，加入功能單體MAA 168 μL（PEOA 和MAA 的摩爾比為1 ∶4）和SiO2-APTES 2 g，25 ℃下攪拌12 h 進(jìn)行預(yù)組裝。再加入交聯(lián)劑EGDMA 952 μL（交聯(lián)度85%）和引發(fā)劑AIBN 0.016 4 g，超聲分散20 min 后通氮?dú)?0 min，密封后于60 ℃下水浴反應(yīng)24 h。將反應(yīng)產(chǎn)物減壓抽濾，并用大量甲醇洗滌，丙酮漂洗。甲醇-冰醋酸（4 ∶1，v／v）索氏洗脫24 h 以除去模板分子，然后依次用乙腈-水（20 ∶80，v／v）、甲醇洗滌，干燥得青霉噻唑酸表面分子印跡聚合物（PEOA-MIPs）。

制備青霉噻唑酸非印跡聚合物（PEOA-NIPs），除不加入模板分子PEOA 外，其他步驟同上。

1.4 聚合物形貌和物理特性的表征

采用掃描電子顯微鏡對(duì)活化硅膠和聚合物進(jìn)行觀察，以獲取樣品表面形貌信息。采用KBr 壓片法分別對(duì)活化硅膠、改性硅膠和PEOA-MIPs 進(jìn)行紅外光譜分析。采用熱重分析儀分別測(cè)定活化硅膠、改性硅膠及印跡聚合物的熱重曲線，并根據(jù)相對(duì)重量損失計(jì)算硅膠表面的聚合物層的重量（公式（1））。對(duì)分子印跡聚合物進(jìn)行元素分析，并根據(jù)元素分析結(jié)果計(jì)算聚合物層的厚度（公式（2）、（3））［20］。

其中：mMIPs為硅膠表面聚合物層的質(zhì)量（mg）；ms為硅膠的質(zhì)量（g）；loss 為由熱重分析所得的質(zhì)量損失；C 為聚合物層的含碳量；mC為每克硅膠表面聚合物層所含碳的質(zhì)量（g）；Mw為聚合物層的加權(quán)平均相對(duì)分子質(zhì)量；MC為聚合物層中碳原子的加權(quán)平均相對(duì)分子質(zhì)量；ρ 為加權(quán)平均密度（g／mL）；S 為硅膠比表面積（m2／g）；d 為聚合物層的厚度（nm）。

1.5 聚合物吸附性能的考察

1.5.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

精密稱定PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 各20.0 mg，置于10 mL 錐形瓶中，加入10 ～800 μg／mL 的PEOA 系列溶液各10 mL，25 ℃恒溫空氣浴振蕩1 h，吸取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC 分析。根據(jù)吸附前后PEOA 濃度的變化計(jì)算聚合物對(duì)PEOA 的吸附量Q（公式（4）），并用Langmuir（公式（5）［21］）與Freundlich（公式（6）［22］）兩種模型分析靜態(tài)吸附數(shù)據(jù)。

其中：C0為吸附前溶液中PEOA 的質(zhì)量濃度（μg／mL）；Ce為吸附后溶液中PEOA 的平衡質(zhì)量濃度（μg／mL）；V 為PEOA 溶液的體積（mL）；W為PEOA-MIPs 或PEOA-NIPs 的質(zhì)量（mg）；Qe為聚合物層的吸附量（mg／g）；KL為L(zhǎng)angmuir 吸附分配系數(shù)（L／mg）；Qm為聚合物層的最大吸附量（mg／g）；KF和n 均為Freundlich 參數(shù)。

1.5.2 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

精密稱定PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 各20.0 mg，置于10 mL 錐形瓶中，分別加入400 μg／mL PEOA 溶液10 mL，25 ℃恒溫空氣浴分別振蕩1、5、10、15、30、45、60、90、120 min。吸取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC 分析。

將吸附動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程（公式（7））和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程（公式（8））分析［23，24］：

其中：Qe為平衡吸附量（mg／g）；Qt為t 時(shí)刻的吸附量（mg／g）；k1為準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程吸附速率常數(shù)（min-1）；k2為準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程吸附速率常數(shù)（g／（mg·min））。

1.5.3 吸附選擇性實(shí)驗(yàn)

精密稱定PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 各20.0 mg，置于10 mL 錐形瓶中，分別加入400 μg／mL 青霉素G、6-氨基青霉烷酸、美洛西林、氯唑西林和奧拉西坦溶液各10 mL，25 ℃下恒溫空氣浴振搖1 h，吸取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。

1.6 MISPE-HPLC 檢測(cè)豬肝中青霉噻唑酸的前處理方法

稱取150 mg PEOA-MIPs 裝入2.5 mL 固相萃取空柱，柱底端和頂端均加封聚丙烯篩板，依次用6 mL 甲醇和6 mL 水沖洗。取空白豬肝臟樣品2.0 g，加入4 mL 生理鹽水勻漿處理，并精密吸取不同濃度青霉噻唑酸溶液200 μL 至勻漿液中，超聲分散后加入6 mL 乙腈沉淀蛋白質(zhì)，于8 000 r／min 下離心10 min，上清液再于12 000 r／min 下離心5 min。取上清液1 mL 上樣，用1 mL 異丙醇淋洗雜質(zhì)，再用3 mL 甲醇-10% 冰醋酸（9 ∶1，v／v）洗脫，收集洗脫液并用氮?dú)獯蹈?，? mL 水復(fù)溶后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC 分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的制備

青霉噻唑酸分子印跡聚合物的制備流程如圖1所示。硅膠顆粒經(jīng)過酸活化處理，使其表面含有羥基基團(tuán)?；罨枘z與APTES 發(fā)生反應(yīng)，將氨基基團(tuán)接枝在硅膠表面。加入的PEOA 和MAA 通過羧基和硅膠表面的氨基相互作用，從而在硅膠表面發(fā)生聚合反應(yīng)，使聚合物層包覆在硅膠表面，洗脫模板后，形成青霉噻唑酸表面分子印跡聚合物。

圖1 青霉噻唑酸分子印跡聚合物的制備流程Fig.1 Preparation process of PEOA-MIPs

在制備過程中功能單體MAA 可能與模板分子PEOA 形成氫鍵，合適的模板分子-功能單體摩爾比有利于聚合物具有更好的特異識(shí)別能力和吸附特性；交聯(lián)劑使模板分子和功能單體聚合形成高度交聯(lián)、剛性的聚合物，在選擇交聯(lián)度時(shí)，既要使聚合物具有一定的剛性以保持良好的空間構(gòu)型，又要具有一定的柔韌性以便易于接近其識(shí)別位點(diǎn)，從而具有良好的識(shí)別性能。理想的溶劑不但有助于模板分子和其他反應(yīng)物的溶解，還可能在一定程度上促進(jìn)模板分子與功能單體之間的相互作用。因此為了使分子印跡聚合物具有最佳的吸附能力，分別對(duì)青霉噻唑酸分子印跡聚合物的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖2。

從圖2a 中可以看出，隨著MAA 的增加，PEOAMIPs 的吸附量逐漸增加；但當(dāng)MAA 用量過多時(shí)，功能單體會(huì)趨于自聚合而形成較多的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致印跡因子（IF）下降。當(dāng)模板分子與功能單體的摩爾比為1 ∶4 時(shí)，所合成的聚合物有良好的識(shí)別能力與吸附能力，為最佳比例。從圖2b 中可以看出，交聯(lián)度為85% 時(shí)，聚合物對(duì)PEOA 的吸附量和印跡因子均相對(duì)最高，因此制備PEOA-MIPs 的最佳交聯(lián)度為85%。從圖2c 中可以看出，當(dāng)甲醇與乙腈的體積比為3 ∶1 時(shí)，所合成的聚合物具有相對(duì)好的印跡因子，但吸附量較低；當(dāng)甲醇與乙腈的體積比為1 ∶1 時(shí)，所合成的聚合物具有相對(duì)好的印跡因子和相對(duì)較高的吸附量，此時(shí)溶劑的極性有利于模板分子與功能單體之間氫鍵作用力的形成，因此甲醇-乙腈（1 ∶1，v／v）為最佳溶劑。綜上，PEOAMIPs 的最優(yōu)制備條件為PEOA／MAA 的摩爾比為1∶4，交聯(lián)度為85%，溶劑為甲醇-乙腈（1 ∶1，v／v）。

圖2 不同制備條件對(duì)PEOA-MIPs 吸附性能的影響Fig.2 Effect of different preparation conditions on adsorption capacity of PEOA-MIPs

2.2 聚合物形貌和物理特性的表征

2.2.1 掃描電鏡分析

借助掃描電子顯微鏡分別對(duì)活化硅膠和聚合物的表面形貌進(jìn)行了觀察，結(jié)果見圖3。與活化硅膠（見圖3a）相比，PEOA-MIPs（見圖3b）和PEOANIPs（見圖3c）的表面更粗糙，表明聚合物層在硅膠表面接枝成功，而PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 并無(wú)明顯差異。

2.2.2 熱重分析

圖3 （a）活化硅膠、（b）PEOA-MIPs 和（c）PEOA-NIPs的掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of （a）activated silica gels，（b）PEOA-MIPs and （c）PEOA-NIPs

圖4 （a）活化硅膠、（b）改性硅膠、（c）PEOA-MIPs 和（d）PEOA-NIPs 的熱重分析曲線Fig.4 TGA curves of （a）activated silica gels，（b）SiO2-APTES，（c）PEOA-MIPs and（d）PEOA-NIPs

活化硅膠、改性硅膠及印跡聚合物在25 ～800℃溫度區(qū)間的熱重曲線見圖4。隨著溫度的升高，活化硅膠和改性硅膠僅少量失重，在800 ℃時(shí)活化硅膠失重7.4%，改性硅膠失重10.7%，3.3% 的差額可能為所接枝APTES 的質(zhì)量損失，表明氨基成功接枝在活化硅膠表面。PEOA-MIPs 和PEOANIPs 的熱重曲線較為相似，在25 ～260 ℃范圍內(nèi)均較穩(wěn)定；之后在260 ～600 ℃范圍內(nèi)均有較大的質(zhì)量損失，隨后曲線趨于平坦，在800 ℃時(shí)PEOA-MIPs和PEOA-NIPs 的總失重分別為29.0% 和38.4%，硅膠表面MIPs 層的重量約為224.0 mg／g。表明聚合物層在硅膠表面接枝成功，并且在25 ～260 ℃具有很好的熱穩(wěn)定性。

2.2.3 紅外光譜分析

活化硅膠、改性硅膠、PEOA-MIPs 的紅外光譜分析結(jié)果見圖5。圖5a 中3 461 cm-1處的吸收峰為活化硅膠表面O-H 的伸縮振動(dòng)峰；圖5b 中1 096和3 446 cm-1處為APTES 中C-N 和N-H 的伸縮振動(dòng)峰，表明硅膠表面成功接枝上-NH2基團(tuán)；圖5c中1 109 cm-1為EGDMA 中C-O 的伸縮振動(dòng)峰，1 563 cm-1處為聚合物骨架上-CH3的伸縮振動(dòng)峰，1 727 cm-1處的強(qiáng)吸收峰可能為MAA 或EGDMA中C＝O 的伸縮振動(dòng)峰，相比圖5b 中N-H 的伸縮振動(dòng)峰變寬，說(shuō)明聚合物中有氫鍵作用存在，結(jié)果表明聚合物成功包覆在硅膠表面。

圖5 （a）活化硅膠、（b）改性硅膠和（c）印跡聚合物的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of （a）activated silica gels，（b）SiO2-APTESand （c）PEOA-MIPs

2.2.4 元素分析

對(duì)分子印跡聚合物進(jìn)行元素分析，結(jié)果見表1。C 和N 元素在聚合物中出現(xiàn)，且MIPs 和NIPs 中碳的含量均較大，經(jīng)計(jì)算得MIPs 和NIPs 的聚合物層厚度（d）分別約為2.17 和3.13 nm，表明功能單體和交聯(lián)劑已接枝到硅膠表面，在硅膠表面附著一定厚度的聚合物。

表1 PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 的元素分析結(jié)果Table 1 Results of elemental analysis of PEOA-MIPs and PEOA-NIPs

2.3 聚合物吸附性能的考察

2.3.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

為考察聚合物層的吸附性能，采用靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了PEOA-MIPs、PEOA-NIPs 和聚合物層的等溫吸附曲線，結(jié)果分別見圖6a、c。隨著溶液中PEOA 濃度的增加，聚合物層的吸附量均增加，當(dāng)溶液濃度增加至600 μg／mL，聚合物層的吸附位點(diǎn)趨于飽和，從而使吸附處于平衡狀態(tài)，MIPs 和NIPs 聚合物層的飽和吸附量分別為122.78 和19.44 mg／g。在整個(gè)吸附過程中，PEOA-MIPs 的吸附量明顯大于PEOA-NIPs，表明PEOA-MIPs 對(duì)PEOA 有特異的吸附能力。在PEOA-MIPs 制備過程中，PEOA 與MAA 之間形成氫鍵、靜電作用力等非共價(jià)作用力，從而使在硅膠表面形成了能與模板分子PEOA 相匹配且具有特異識(shí)別位點(diǎn)的三維孔穴結(jié)構(gòu)，因此PEOA-MIPs 除有同PEOA-NIPs 一樣的非特異性吸附外，還存在對(duì)模板分子的特異性吸附位點(diǎn)。

將聚合物層的等溫吸附數(shù)據(jù)用Langmuir 與Freundlich 兩種模型進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。Langmuir 相比Freundlich 方程有更好的相關(guān)系數(shù)（R2），聚合物層對(duì)PEOA 的吸附行為符合Langmuir 模型，表明聚合物層對(duì)PEOA 的吸附是單分子層吸附。

表2 Langmuir 與Freundlich 模型的等溫吸附參數(shù)Table 2 Adsorption isotherm constants for Langmuir and Freundlich equations

2.3.2 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

為了研究PEOA-MIPs 達(dá)到吸附平衡所需的時(shí)間和吸附速率，PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 吸附動(dòng)力學(xué)曲線見圖6b。PEOA-MIPs 對(duì)青霉噻唑酸的吸附量在短時(shí)間內(nèi)有很大的增加，在45 min 時(shí)吸附量變化趨于平緩，達(dá)到吸附平衡；且在任何時(shí)間段PEOA-MIPs 的吸附量均明顯高于PEOA-NIPs。說(shuō)明能與模板分子相互匹配且?guī)в凶R(shí)別位點(diǎn)的三維空穴大都存在于聚合物的表面，因此可以快速地吸附目標(biāo)化合物。

用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果見表3。準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的相關(guān)系數(shù)（R2）優(yōu)于準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，聚合物對(duì)PEOA 的吸附動(dòng)力學(xué)符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，表明PEOA-MIPs 吸附識(shí)別過程主要為化學(xué)吸附，PEOA-MIPs 具有快速的傳質(zhì)速率和結(jié)合動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)。

表3 準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic constants for pseudo-first-order rate and pseudo-second-order rate equations

圖6 PEOA-MIPs 和PEOA-NIPs 的（a）等溫吸附曲線、（b）吸附動(dòng)力學(xué)曲線和（c）聚合物層的等溫吸附曲線Fig.6 （a）Adsorption isotherms，（b）kinetics of PEOA-MIPs，PEOA-NIPs and （c）adsorption isotherms of polymer layers

2.3.3 吸附選擇性實(shí)驗(yàn)

為考察PEOA-MIPs 對(duì)模板分子的選擇性識(shí)別能力，選擇6-氨基青霉烷酸、青霉素G、美洛西林、氯唑西林和奧拉西坦作為類似物進(jìn)行吸附選擇性實(shí)驗(yàn)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和聚合物對(duì)其的吸附選擇性結(jié)果見圖7。PEOA-MIPs 對(duì)青霉噻唑酸的吸附能力最強(qiáng)，印跡因子為6.3，6-氨基青霉烷酸、青霉素G、美洛西林、氯唑西林和奧拉西坦的印跡因子分別為2.5、1.8、4.1、1.8 和1.0。在聚合物制備過程中，模板分子PEOA 在硅膠表面留下與PEOA 空間結(jié)構(gòu)相匹配且具有特異識(shí)別位點(diǎn)的三維孔穴，因此對(duì)于非結(jié)構(gòu)類似物奧拉西坦的吸附量很少，且無(wú)特異性吸附。對(duì)于6-氨基青霉烷酸、青霉素G、美洛西林和氯唑西林，結(jié)構(gòu)上與青霉噻唑酸類似，存在可與PEOAMIPs 相互作用的位點(diǎn)，但空間結(jié)構(gòu)的差異影響了聚合物的吸附能力，因此PEOA-MIPs 對(duì)其的吸附量較低，印跡因子也低于青霉噻唑酸。表明PEOAMIPs 對(duì)模板分子有高度的選擇性和識(shí)別能力。

2.4 聚合方法的比較

將所得硅膠表面分子印跡聚合物與文獻(xiàn)報(bào)道采用表面分子印跡聚合法所得的聚合物進(jìn)行比較。Wei 等［25］采用溶膠-凝膠技術(shù)制備了對(duì)咖啡因具有特異識(shí)別能力的表面分子印跡聚合物，飽和吸附量為3.88 mg／g，該法制備條件溫和，操作簡(jiǎn)便，但在制備過程中凝膠化的程度不易控制，溶膠-凝膠印跡層易發(fā)生收縮和干裂，導(dǎo)致部分結(jié)合位點(diǎn)被破壞，因此該法制備的聚合物存在對(duì)目標(biāo)分子吸附容量低的問題，且該法制備過程耗時(shí)較長(zhǎng)（72 h）。Li 等［26］采用表面印跡犧牲載體法制備了對(duì)鹽酸小檗堿具有特異識(shí)別能力的分子印跡聚合物，所制備的顆粒形狀規(guī)整，多孔性好，但當(dāng)載體硅膠用氫氟酸除去后，導(dǎo)致聚合物機(jī)械穩(wěn)定性和抗壓性差，不宜用作色譜填料或固相萃取介質(zhì)，且制備過程繁瑣。本文利用硅膠表面的羥基基團(tuán)，以APTES 修飾硅膠，從而將聚合物層嫁接在硅膠表面，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)較短（24 h），接枝聚合法增大了聚合物層結(jié)合位點(diǎn)的可接近性，使其具有更好的吸附特性，且具有機(jī)械穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。

2.5 樣品分析

由于分子印跡聚合物對(duì)模板分子具有特異性吸附能力，因此常與固相萃取技術(shù)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的富集、分離和純化。本文將制備的PEOAMIPs 應(yīng)用于固相萃取介質(zhì)，制備了分子印跡固相萃取小柱，并與HPLC 結(jié)合，應(yīng)用于豬肝中青霉噻唑酸的分離和分析。經(jīng)過MISPE 凈化前后樣品的HPLC 色譜圖見圖8。經(jīng)過MISPE 凈化后豬肝中內(nèi)源性雜質(zhì)明顯減少，表明MISPE 預(yù)處理可以有效地消除樣品中雜質(zhì)的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中PEOA 的富集和純化。豬肝樣品中PEOA 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果見表4。PEOA 的回收率為87.2% ～92.3%，RSD 均小于7.9%，表明該法可用于實(shí)際樣品中微量PEOA 的富集、分離和分析。

圖7 PEOA 及其類似物的（a）化學(xué)結(jié)構(gòu)和（b）PEOA-MIPs 對(duì)PEOA 及其類似物的吸附選擇性Fig.7 （a）Chemical structures of PEOA and its analogues and （b）adsorption selectivity of PEOA-MIPs for PEOA and its analogues

圖8 加標(biāo)豬肝樣品的色譜圖Fig.8 Chromatograms of spiked pork liver samples

表4 豬肝樣品中PEOA 的回收率（n＝3）Table 4 Recoveries of PEOA in pork liver samples （n＝3）

3 結(jié)論

以青霉素中致敏性雜質(zhì)青霉噻唑酸為模板分子，采用表面分子印跡聚合法制備了PEOA-MIPs，并對(duì)制備條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過SEM、FT-IR、TGA和元素分析結(jié)果顯示聚合物層已成功接枝在硅膠表面，并具有良好的熱穩(wěn)定性。吸附性能研究發(fā)現(xiàn)PEOA-MIPs 對(duì)PEOA 具有良好的吸附性能和特異選擇識(shí)別能力，靜態(tài)吸附符合Langmuir 方程，其飽和吸附量為122.78 mg／g，并可在45 min 內(nèi)達(dá)到吸附平衡，且吸附速率符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，PEOAMIPs 對(duì)目標(biāo)物的吸附是以化學(xué)吸附為主的單分子層吸附。所制備的PEOA-MIPs 具有更大的吸附量、更快的吸附速率和更好的識(shí)別能力，并用于萃取介質(zhì)，結(jié)合液相色譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)豬肝中青霉噻唑酸的富集和分析，對(duì)于提高青霉素類藥物的安全性和控制食品的質(zhì)量具有重要意義。

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