龍 珍 ， 金 燕， 劉曉達(dá)， 郭志謀 ， 沈愛金， 胡興娟， 吳寧鵬

（1. 賽默飛世爾（中國）科技有限公司，北京100080；2. 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116023；3. 河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州450008）

病毒性疾病是目前世界上發(fā)病率最高的疾病之一，嚴(yán)重威脅著禽類、獸類，甚至人類的生命安全。為了有效預(yù)防和控制病毒性疾病的發(fā)起和傳播，需要根據(jù)不同的發(fā)病機(jī)理針對(duì)性地使用不同的抗病毒藥物［1，2］。病毒性疾病起因復(fù)雜多樣，因此市面上的抗病毒藥物也多種多樣，如三環(huán)胺類抗病毒藥物金剛乙胺等；核苷類抗病毒藥物阿昔洛韋、利巴韋林等。病毒性疾病的控制和預(yù)防往往需要多種抗病毒藥物同時(shí)使用。發(fā)展多種抗病毒藥物的同時(shí)分離分析和定量方法，有利于研究藥物代謝機(jī)理、監(jiān)測(cè)禽類產(chǎn)品中抗病毒藥物的殘留。

利巴韋林、更昔洛韋［3］、泛昔洛韋［4，5］、伐昔洛韋［6］和金剛乙胺是常見的抗病毒藥物。然而，要實(shí)現(xiàn)這幾種藥物的同時(shí)分離、檢測(cè)較為困難。電離狀態(tài)下的金剛乙胺極性較強(qiáng)，反相色譜模式中保留較弱。為了增強(qiáng)金剛乙胺在反相色譜柱上的保留，常用堿性溶液作流動(dòng)相。但即使在游離狀態(tài)下，由于金剛乙胺分子的強(qiáng)極性，反相色譜保留仍然較弱。親水作用色譜（HILIC）是反相色譜的有力補(bǔ)充［7-15］，可為極性化合物提供較好的保留和獨(dú)特的分離選擇性。金剛乙胺［16-18］和利巴韋林［19］的紫外吸收較弱，需要在低波長下或者衍生的情況下才能用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。衍生方法具有較高的靈敏度，但該方法操作復(fù)雜，重復(fù)性較差，并且不是所有的化合物都具有衍生所需的基團(tuán)。電霧式檢測(cè)器（CAD）和質(zhì)譜等通用型檢測(cè)器是紫外檢測(cè)器的有力補(bǔ)充，可以提高紫外吸收較弱化合物的檢測(cè)靈敏度，并且不需要繁瑣的衍生步驟。質(zhì)譜可為抗病毒藥物的檢測(cè)提供較高的靈敏度［20］，但其價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、定量穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性受諸多因素的影響。CAD 是近年來發(fā)展起來的一種通用型檢測(cè)器，該檢測(cè)器操作簡單且具有較高的檢測(cè)靈敏度和較寬的線性范圍［21-26］。

本文以親水色譜柱Click TE-Cys［27，28］為固定相，CAD 為檢測(cè)器，發(fā)展了一種可實(shí)現(xiàn)5 種抗病毒藥物同時(shí)分離的液相色譜方法。與反相液相色譜方法和其他HILIC 方法相比，該方法具有較好的峰形和分離選擇性，可實(shí)現(xiàn)5 種抗病毒藥物的同時(shí)分離和定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

乙腈（色譜純，ThermoFisher 公司）；甲酸（FA，純度99%）、甲酸銨（純度99.9%）（Acros 公司）；利巴韋林（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH），泛昔洛韋、伐昔洛韋、更昔洛韋和金剛乙胺（中國振翔科技有限公司）。低壓四元色譜系統(tǒng)（ThermoFisher 公司），配置LPG-3400SD 低壓四元色譜泵、WPS-3000TSL 自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3200 柱溫箱、VWD-3100紫外-可見波長檢測(cè)器、Corona Veo RS 電霧式檢測(cè)器、變色龍色譜管理軟件Chromeleon 7.2。分析柱Acclaim C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）（ThermoFisher 公司）；ZIC-pHILIC （150 mm×4.6 mm，5 μm）（美國Merck 公司）；Click TE-Cys （150 mm×4.6 mm，5 μm）（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所）。

1.2 色譜條件

反相色譜分離以Acclaim C18 為色譜柱，流動(dòng)相A 為乙腈，B 為0.1% （v／v）FA 水溶液，洗脫梯度為0 ～15 min，5% A ～18% A。以ZIC-pHILIC 為固定相的親水色譜分離，流動(dòng)相A 為乙腈，B 為10 mmol／L 甲酸銨（pH 2.9），洗脫梯度為0 ～30 min，90% A ～70% A。以Click TE-Cys 為固定相的親水色譜分離，流動(dòng)相A 為乙腈，B 為100 mmol／L 甲酸銨（pH 2.9），C 為水。流速：1 mL／min；柱溫：30℃；紫外檢測(cè)波長：254 nm。CAD 檢測(cè)條件：蒸發(fā)溫度35 ℃；過濾模式5；采集頻率10 Hz；PFV（power function value）值1.3。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)器的影響

以Acclaim C18 為固定相，分別用CAD 和紫外檢測(cè)器檢測(cè)幾種抗病毒藥物的響應(yīng)情況，如圖1a 所示，利巴韋林的紫外吸收較弱，在254 nm 波長下響應(yīng)較小；金剛乙胺無法用紫外檢測(cè)器直接檢測(cè)。因此無法用紫外檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)5 種抗病毒藥物。CAD 是一種通用型檢測(cè)器，它是檢測(cè)分析物顆粒表面的電荷量，適合半揮發(fā)和難揮發(fā)的化合物。CAD的響應(yīng)與分析物的質(zhì)量成比例，與分析物的光學(xué)性質(zhì)無關(guān)。如圖1b 所示，5 種抗病毒藥物在CAD 中都有較好的響應(yīng)。因此，在下面的分離模式和流動(dòng)相條件優(yōu)化過程中以CAD 為檢測(cè)器。

2.2 分離模式及色譜柱的選擇

圖1 5 種抗病毒藥物在（a）紫外-可見波長檢測(cè)器和（b）CAD檢測(cè)下的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the five drugs obtained with（a）a UV-Vis detector and （b）a CAD

以3 種不同色譜柱：親水色譜柱（ZIC-pHILIC和Click TE-Cys）和反相色譜柱（Acclaim C18）為固定相進(jìn)行抗病毒藥物的分離，并以CAD 為檢測(cè)器檢測(cè)。如圖2a 所示，在反相色譜模式中，金剛乙胺在死時(shí)間附近出峰，無法與死時(shí)間附近出峰的雜質(zhì)分離。在C18 色譜柱上，泛昔洛韋和抗生素水溶液中一雜質(zhì)共洗脫，無法實(shí)現(xiàn)泛昔洛韋的定量分析。親水色譜模式是反相色譜模式的有力補(bǔ)充。如圖2b 所示，在ZIC-pHILIC 色譜柱上，金剛乙胺與雜質(zhì)可以得到較好的分離。但5 種堿性抗病毒藥物在ZIC-pHILIC 上都存在不同程度的拖尾和色譜峰展寬，導(dǎo)致分離度下降和檢測(cè)靈敏度降低。如拖尾導(dǎo)致更昔洛韋和伐昔洛韋、利巴韋林和相鄰雜質(zhì)無法分離。此外，嚴(yán)重的拖尾和色譜峰展寬導(dǎo)致金剛乙胺檢測(cè)靈敏度降低，甚至無法檢測(cè)。與ZIC-pHILIC相比，以Click TE-Cys 為固定相時(shí)所有待檢測(cè)物質(zhì)都可以獲得更好的峰形（不對(duì)稱因子As＜1.3）、更窄的峰寬（半峰寬W1／2＜0.18 min）和更高的檢測(cè)靈敏度。如以ZIC-pHILIC 為固定相，泛昔洛韋的峰高為21 pA；以Click TE-Cys 為固定相，泛昔洛韋的峰高為44 pA。與反相色譜分離相比，Click TE-Cys具有不同的分離選擇性，5 種目標(biāo)化合物均得到基線分離（分離度Rs＞1.5）。此外，在Click TE-Cys上可以分離檢測(cè)到一些無法在反相色譜模式中分離的雜質(zhì)，如圖2c 中出峰時(shí)間為2.5、2.9、4.8 和8.5 min 的色譜峰。更好的分離度保證了各目標(biāo)化合物更準(zhǔn)確的定量。與蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）一樣，CAD 的響應(yīng)隨流動(dòng)相中有機(jī)相含量的增加而增加。反相色譜流動(dòng)相中的乙腈含量遠(yuǎn)低于親水色譜模式，因此5 種抗病毒藥物在反相色譜模式中的響應(yīng)低于在親水色譜模式中的響應(yīng)。以Click TE-Cys為固定相，分析物中峰高最高的化合物的峰高是反相色譜模式下最高峰高的5 倍。

圖2 （a）Acclaim C18、（b）ZIC-pHILIC 和（c）Click TECys 分析5 種抗病毒藥物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the five drugs obtained with（a）Acclaim C18，（b）ZIC-pHILIC and （c）Click TE-Cys columns

2.3 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

在HILIC 分離中，鹽濃度和乙腈濃度對(duì)化合物的保留行為都有較為顯著的影響。在鹽濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，保持緩沖鹽的種類、pH（2.9）和乙腈梯度曲線不變，分別選取10、15 和20 mmol／L 甲酸銨（pH 2.9）作為緩沖鹽，考察鹽濃度對(duì)目標(biāo)化合物分離的影響。如圖3 所示，隨著鹽濃度的增加，化合物的保留時(shí)間稍有減少（＜1 min）。隨著鹽濃度的增加，化合物的選擇性稍有變化，如利巴韋林、金剛乙胺以及介于兩者之間的雜質(zhì)。但無論用哪種鹽濃度，都可以實(shí)現(xiàn)5 種抗病毒藥物的分離。為了減少鹽對(duì)檢測(cè)靈敏度度的影響，選擇10 mmol／L 甲酸銨（pH 2.9）為流動(dòng)相添加劑。

圖3 甲酸銨濃度對(duì)5 種抗病毒藥物分離的影響Fig.3 Effect of ammonium formate concentration on separation of the five antiviral drugs

在乙腈濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，分別選取85% ～75%、80% ～70%、75% ～65% 乙腈作為有機(jī)相梯度，同時(shí)保持流動(dòng)相中緩沖鹽種類、濃度和pH 值不變。如圖4 所示，所有化合物的保留時(shí)間都隨流動(dòng)相中乙腈濃度的增加而增加。以伐昔洛韋為例，使用乙腈梯度85% ～75%、80% ～70%、75% ～65% 時(shí)，保留時(shí)間分別為5.5、8.0 和11.7 min。為了實(shí)現(xiàn)較快的分離且保證幾種抗病毒藥物及雜質(zhì)間較好的分離，選擇乙腈梯度為80% ～70%。

圖4 乙腈梯度對(duì)5 種抗病毒藥物分離的影響Fig.4 Effect of acetonitrile gradient on separation of the five antiviral drugs

2.4 線性范圍和檢出限

按照優(yōu)化后的色譜條件，在0.07 ～2.28 mg／mL 范圍內(nèi)取5 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)濃度進(jìn)樣3 次，每次進(jìn)樣5 μL。如表1 所示，以峰面積為縱坐標(biāo)（A），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C，mg／mL），考察利巴韋林、更昔洛韋、伐昔洛韋、泛昔洛韋和金剛乙胺的線性范圍，并以S／N＝10 確定了5 種抗病毒藥物的定量限。

表1 5 種抗病毒藥物的線性關(guān)系及LOQTable 1 Linear relationships and LOQs of the five antiviral drugs

2.5 方法的重復(fù)性

以質(zhì)量濃度為1.0 mg／mL 的金剛乙胺、利巴韋林、更昔洛韋、泛昔洛韋和伐昔洛韋混合溶液為樣品，平行測(cè)定5 次，檢測(cè)本方法的峰面積重復(fù)性（見表2）。本方法測(cè)定泛昔洛韋、金剛乙胺、利巴韋林、更昔洛韋和伐昔洛韋有較好的日內(nèi)重復(fù)性（RSD≤3.06%）和日間重復(fù)性（RSD≤5.38%）。

表2 5 種抗病毒藥物峰面積的日內(nèi)（n＝5）和日間重復(fù)性（n＝3）Table 2 Intra-day （n＝5）and inter-day （n＝3）peak area repeatability of the five antiviral drugs

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以Click TE-Cys 為固定相，CAD 為檢測(cè)器，建立了多種抗病毒藥物同時(shí)分離檢測(cè)的方法。該方法可為所選藥物提供良好的峰形和獨(dú)特的分離選擇性?？疾炝瞬煌臋z測(cè)器、色譜模式、色譜柱和實(shí)驗(yàn)條件對(duì)抗病毒藥物的響應(yīng)、峰形和分離選擇性的影響，可為同類化合物的分離提供參考。本實(shí)驗(yàn)發(fā)展的方法具有較寬的線性和較高的靈敏度，可用于相關(guān)藥物的定量、定性分析。

［1］ Cirelli R，Herne K，McCrary M，et al. Antivir Res，1996，29：141

［2］ Boyd M R，Bacon T H，Sutton D，et al. Antimicrob Agents Chemother，1987，31：1238

［3］ Merodio M，Campanero M A，Mirshahi T，et al. J Chromatogr A，2000，870：159

［4］ Mondal P，Neeraja B. Der Pharm Lett，2013，5（4）：320

［5］ Mannur V S，Kumar B S，Masthiholimath V S. Int J Pharm Pharm Sci，2011，3（Suppl 4）：198

［6］ Sugumaran M，Bharathi V，Hemachander R，et al. Der Pharm Chem，2011，3（4）：190

［7］ Kumar A，Heaton J C，McCalley D V. J Chromatogr A，2013，1276：33

［8］ Gray N，Heaton J，Musenga A，et al. J Chromatogr A，2013，1289：37

［9］ West C，Khater S，Lesellier E. J Chromatogr A，2012，1250：182

［10］ Taylor L T. J Chromatogr A，2012，1250：196

［11］ Shen A，Guo Z，Cai X，et al. J Chromatogr A，2012，1228：175

［12］ Fu Q，Wang J，Liang T，et al. Chinese Journal of Chromatography （傅青，王軍，梁圖，等. 色譜），2013，31（11）：1051

［13］ Ibrahim M E A，Liu Y，Lucy C A. J Chromatogr A，2012，1260：126

［14］ Heaton J，Gray N，Cowan D A，et al. J Chromatogr A，2012，1228：329

［15］ Dong X，Shen A，Gou Z，et al. Carbohydr Res，2012，361：195

［16］ Higashi Y，F(xiàn)ujii Y. J Chromatogr Sci，2005，43：213

［17］ Higashi Y，Uemori I，F(xiàn)ujii Y. Biomed Chromatogr，2005，19：655

［18］ Shuangjin C，F(xiàn)ang F，Han L，et al. J Pharm Biomed Anal，2007，44：1100

［19］ Granich G G，Krogstad D J，Connor J D，et al. Antimicrob Agents Chemother，1989，33：311

［20］ Chantelle B H，Glenn T，Paul S，et al. J Chromatogr B，2014，945／946：225

［21］ Eom H Y，Park S Y，Kim M K，et al. J Chromatogr A，2010，1217：4347

［22］ Hutchinson J P，Li J，F(xiàn)arrell W，et al. J Chromatogr A，2011，1218：1646

［23］ Joseph A，Rustum A. J Pharmaceut Biomed Anal，2010，51：521

［24］ Sun P，Wang X D，Alquier L. J Chromatogr A，2008，1177：87

［25］ Takahashi K，Kinugasa S，Senda M，et al. J Chromatogr A，2008，1193：151

［26］ Vehovec T，Obreza A. J Chromatogr A，2010，1217：1549

［27］ Guo X，Zhang X，Guo Z，et al. J Chromatogr A，2014，1325：121

［28］ Wei J，Shen A，Wan H，et al. J Sep Sci，2014，37：1781