劉 蕓， 丁 濤* ， 徐素麗， 吳 斌， 沈崇鈺，張 睿， 王 艷， 費(fèi)曉慶

（1. 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇 南京210001；2. 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京210001）

低聚果糖（fructo-oligosaccharides，F(xiàn)OS），又名蔗果低聚糖、寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，它是由蔗糖和1～3 個(gè)果糖基通過(guò)β-1，2 糖苷鍵結(jié)合而成的聚合度（DP）為2～9 的低聚糖。低聚果糖包括蔗果三糖（1-kestose，GF2）、蔗果四糖（nystose，GF3）和 蔗 果 五 糖（1-F-β-fructofuranosyl nystose，GF4）［1，2］。低聚果糖具有良好的生理功能，特別對(duì)人體內(nèi)微生物環(huán)境有雙向調(diào)節(jié)作用，增加人體內(nèi)有益菌群雙歧桿菌，抑制有害菌的繁殖，改善腸道環(huán)境，防止便秘；此外還具有降低血清膽固醇、促進(jìn)人體內(nèi)B 族維生素的合成，預(yù)防齲齒、提高機(jī)體免疫力等重要功能，又被稱作雙歧因子［3］。目前已廣泛使用于奶粉、牛奶和乳飲料等各類食品中作為功能性配料［4-8］。如何準(zhǔn)確、快速地對(duì)低聚果糖的含量進(jìn)行檢測(cè)，成為國(guó)家食品安全監(jiān)管部門和生產(chǎn)廠商迫切需要解決的問(wèn)題。

食品中添加的低聚果糖主要有兩種來(lái)源，一種是以蔗糖為原料，由果糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化、精制而得到，其主要成分為GF2、GF3和GF4；另一種是以菊苣或菊芋提取的菊粉為原料，經(jīng)酶解或酸解而生成的果聚糖，其主要包括果果三糖（inulo-triose，F(xiàn)2）、果果四糖（inulo-tetraose，F(xiàn)3）和果果五糖（inulopentaose，F(xiàn)4）［9］。目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有相應(yīng)的檢測(cè)低聚果糖含量的方法，AOAC 997.08［10］規(guī)定了采用酶解法可以定量檢測(cè)食物中的果聚糖和低聚果糖，該方法適用于以菊粉為原料經(jīng)過(guò)酶解制得的低聚果糖的定量分析。而國(guó)內(nèi)食品中添加的低聚果糖以第一種來(lái)源為主，直接采用適合的溶劑浸提，GF2、GF3、GF4就可以游離出來(lái)，無(wú)需采用復(fù)雜的酶解法處理。

由于低聚糖類物質(zhì)沒(méi)有紫外吸收，目前的研究中，對(duì)其含量測(cè)定通常采用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器（HPLC-RID）的方法［11，12］、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）［13，14］和離子色譜法［15，16］。HPLC-RID 法要求色譜系統(tǒng)平衡時(shí)間較長(zhǎng)，分析過(guò)程中要求恒溫，且無(wú)法進(jìn)行梯度洗脫［17］，同時(shí)由于其檢測(cè)靈敏度不高，只能測(cè)定低聚果糖含量較高的樣品，而國(guó)內(nèi)添加益生元的食品中低聚果糖的含量在0.5% ～2% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)），因此，HPLCRID 不適用于低聚果糖的測(cè)定。HPLC-ELSD 和離子色譜法克服了HPLC-RID 方法的不足，雖然靈敏度較好，能夠達(dá)到分析檢測(cè)的要求，但是抗基質(zhì)干擾能力差，添加低聚果糖的乳粉和乳制品中一般也會(huì)含有一些單糖和雙糖，而這些單雙糖的分離會(huì)影響到低聚果糖的準(zhǔn)確定量；對(duì)于基質(zhì)簡(jiǎn)單的樣品，要達(dá)到低聚果糖的良好分離度，則需要犧牲分析時(shí)間；而對(duì)于基質(zhì)較復(fù)雜的樣品，HPLC-ELSD 和離子色譜法則會(huì)存在定量結(jié)果不準(zhǔn)確以及樣品前處理復(fù)雜等不足。耿麗娟等［9］在運(yùn)用離子色譜法測(cè)定奶粉中低聚果糖時(shí)前處理還需要用SPE 柱進(jìn)行樣品脫脂處理，步驟較繁瑣，且分析時(shí)間為30 min，不能滿足高通量分析。本研究針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的乳粉和米粉樣品，充分利用高效液相色譜-四極桿／靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜靈敏度高和抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)，建立了一種前處理過(guò)程簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料

四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive（賽默飛世爾科技公司），配備有HESI-Ⅱ源，液相色譜系統(tǒng)為Dionex 3000 高壓液相色譜，自動(dòng)進(jìn)樣器；渦旋混合器（XW-80A 型，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；高速離心機(jī)（Sigma，德國(guó)公司）；LP403 分析天平（賽多利斯，德國(guó)公司）。

低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)樣品采用日本株式會(huì)社的色譜級(jí)標(biāo)準(zhǔn)試劑套裝，包含蔗果三糖（純度99.9%）、蔗果四糖（純度99.9%）、蔗果五糖（純度99.9%）；乙腈（色譜純）購(gòu)自德國(guó)Merck 公司；冰醋酸（色譜純）購(gòu)自美國(guó)TEDIA 公司；乙酸鋅（分析純）購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。所有實(shí)驗(yàn)用水均由Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)）制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱量10.0 mg（精確至0.1 mg）蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容至10 mL，配成1.0 g／L 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，密封保存于4 ℃冰箱中。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：根據(jù)需要，吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水逐級(jí)稀釋，分別稀釋成0.1、0.2、0.5 和1.0 mg／L 低聚果糖混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，于4 ℃冰箱中貯存。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取奶粉樣品1 g 于50 mL 容量瓶中，加入約20 mL 左右的水，渦旋30 s 混合均勻，加入1 mL 濃度為10 mmol／L 的乙酸鋅水溶液混合均勻后，超聲20 min，最后加水定容，混合均勻后取適量溶液采用2 000 r／min 的離心機(jī)高速離心5 min，經(jīng)0.22 μm 的水相濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，稀釋10 倍供高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀測(cè)定。如果低聚果糖濃度仍較高，可根據(jù)線性范圍適當(dāng)稀釋。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Carbohydrate（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；流速0.60 mL／min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫箱溫度25 ℃。采用梯度洗脫的分離模式，具體洗脫程序?yàn)椋? ～2 min，80% B；2 ～5 min，80% B ～20%B；5～8.5 min，20%B；8.5 ～9 min，20% B ～80%B；9～10 min，80%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

可加熱的電噴霧離子源（HESI-Ⅱ）；采用正離子掃描模式；毛細(xì)管溫度320 ℃，鞘氣（N2）流速50 L／min，輔助氣（N2）流速8 L／min，吹掃氣（N2）流速5 L／min；噴霧電壓3 kV，透鏡電壓50 V；采用正離子Target-MS／MS 掃描模式；分辨率R ＝35 000，碰撞能30 eV，AGC target 2e5，最大駐留時(shí)間100 ms，分離窗口m／z 4.0 。

2 結(jié)果和討論

2.1 沉淀劑的選擇

奶粉基質(zhì)復(fù)雜，含有大量蛋白，因此在實(shí)驗(yàn)前，首先選擇合適的沉淀劑進(jìn)行處理。常用除蛋白的方法有乙腈、酸、鹽沉淀法和等電點(diǎn)法。雖然乙腈是揮發(fā)性的有機(jī)溶劑，具有較好的沉淀蛋白的作用，與液相色譜-質(zhì)譜方法的處理步驟相匹配，但其對(duì)于奶粉樣品中的蛋白沉淀不完全，因此不使用該方法，實(shí)驗(yàn)比較了（A）6% （v／v）冰醋酸水溶液、（B）10 mmol／L 乙酸鋅水溶液和（C）等電點(diǎn)調(diào)節(jié)pH 法（用5 mol／L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 為1.90±0.50，放置2 min，再用5 mol／L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 為4.70±0.50）3 種方法的差異。

以空白國(guó)內(nèi)嬰幼兒配方奶粉（S1）和國(guó)外某品牌嬰幼兒奶粉（S2）為例，比較了不同方法沉淀蛋白的回收率情況，結(jié)果如表1 所示。中性乙酸鋅沉淀蛋白的回收率最高，其次為冰乙酸溶液，而等電點(diǎn)法回收率最低。文獻(xiàn)［4］報(bào)道，強(qiáng)酸會(huì)分解部分雙糖和低聚糖，可能導(dǎo)致等電點(diǎn)法回收率最低。因此，最終選擇10 mmol／L 乙酸鋅水溶液作為奶粉中低聚果糖測(cè)定的蛋白沉淀劑。

表1 采用不同沉淀蛋白方式處理奶粉樣品的比較Table 1 Comparison of different precipitation methods for milk powder samples

2.2 色譜柱和色譜條件的優(yōu)化

對(duì)于糖的分析，常用的是氨基柱和碳水化合物柱。考慮到色譜柱的使用壽命，選用碳水化合物柱對(duì)低聚果糖進(jìn)行分析。碳水化合物柱屬于正相色譜柱，乙腈比例由多到少變化時(shí)，對(duì)分析物的洗脫能力逐漸增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)主要對(duì)Carbohydrate（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）和Carbohydrate（150 mm×4.6 mm，5 μm）兩種規(guī)格的色譜柱進(jìn)行了比較。對(duì)于低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品的分離，兩種色譜柱均顯示了相同的較好的分離度；但對(duì)于奶粉實(shí)際樣品的分離，由于基質(zhì)復(fù)雜、干擾較大，兩種色譜柱的效果都不令人滿意。大部分添加低聚果糖的奶粉中會(huì)含有一些單糖和雙糖，而這些單糖和雙糖的分離會(huì)對(duì)低聚果糖的準(zhǔn)確定量產(chǎn)生影響，所以實(shí)驗(yàn)中選用柱效高、填料粒徑較小的2.6 μm 的色譜柱。同時(shí)，也確立了梯度洗脫的程序?qū)?shí)際樣品進(jìn)行分離分析，以排除基質(zhì)干擾的影響。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在ESI＋模式下，采用流動(dòng)注射方式，首先對(duì)GF2、GF3和GF4進(jìn)行高分辨質(zhì)譜全掃描，以準(zhǔn)分子離子［M＋H］＋理論精確質(zhì)量數(shù)提取色譜圖。在全掃描采集模式下分辨率（R）為35 000 時(shí)，得到一級(jí)全掃描的質(zhì)譜圖，分析物相對(duì)質(zhì)量偏差小于5×10-6。但在實(shí)際奶粉樣品測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖提取的色譜峰干擾較大，不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量（見圖1a）。換用Target-SIM 質(zhì)譜模式后，發(fā)現(xiàn)實(shí)際樣品中的干擾仍然無(wú)法消除。

因此在Target-MS／MS 模式下，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分離分析，在碰撞能為30 eV 時(shí)，以［M＋H］＋離子為母離子得到的二級(jí)碎片離子的全掃描質(zhì)譜圖見圖2，選擇豐度相對(duì)較高和相對(duì)分子質(zhì)量較大的碎片離子，GF2、GF3和 GF4選 擇 的 子 離 子 均 為347.079 85，實(shí)際奶粉樣品沒(méi)有干擾，具體質(zhì)譜圖如圖1b 所示。

圖1 實(shí)際樣品中GF2、GF3 和GF4 的（a）一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖和（b）二級(jí)提取離子流色譜圖Fig.1 （a）First-full-scan accurate mass spectra and （b）second-extracted chromatograms of GF2，GF3 and GF4 in milk samples

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 線性范圍及檢出限

基于優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件，采用Orbitrap 高分辨質(zhì)譜對(duì)1.2 節(jié)配制的GF2、GF3和GF4混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。分別以各物質(zhì)二級(jí)定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)y、以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白樣品中添加低濃度的各目標(biāo)化合物，獲得信噪比為3（S／N ＝3）時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為此方法的檢出限，獲得信噪比為10（S／N ＝10）時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為此方法的定量限。所得結(jié)果如表2 所示。GF2、GF3和GF4的相關(guān)系數(shù)（r）大于0.998，且在0.1～2.0 mg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 GF2、GF3 和GF4 的線性方程、相關(guān)系數(shù)、保留時(shí)間、檢出限和定量限Table 2 Regression equations，correlation coefficients （r），retention times （tR），limits of detection （LODs，n＝5）and limits of quantification （LOQs，n＝5）of the GF2，GF3 and GF4 compounds

圖2 GF2、GF3 和GF4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Second-full-scan accurate mass spectra of GF2，GF3 and GF4

2.4.2 回收率和精密度

分別對(duì)空白國(guó)內(nèi)嬰幼兒配方奶粉（S1）和國(guó)外嬰幼兒奶粉（S2）進(jìn)行了5、10 和20 mg／kg 共3 個(gè)不同添加水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，對(duì)于每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定5 次，測(cè)得GF2、GF3和GF4的回收率范圍和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍見表3，可以看出，回收率在75.8%～107.3% 范圍內(nèi)，RSD 在1.6% ～8.3%范圍內(nèi)?？梢?，該方法對(duì)不同品牌奶粉的檢測(cè)具有通用性，能夠用于日常分析檢測(cè)。

表3 2 種不同品牌奶粉中GF2、GF3 和GF4 的加標(biāo)回收率（n＝5）Table 3 Recoveries of GF2，GF3 and GF4 spiked in two different kinds of milk samples （n＝5）

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

本研究以實(shí)驗(yàn)室從各超市抽查的樣品為分析對(duì)象，其中包括不同品牌的5 種進(jìn)口嬰幼兒奶粉和5種國(guó)產(chǎn)奶粉（包括2 種孕婦奶粉、2 種嬰幼兒配方奶粉、1 種老年奶粉），按照1.3 節(jié)的樣品前處理方法處理樣品，采用優(yōu)化后的LC-MS／MS 條件定性和定量分析奶粉中的低聚果糖，結(jié)果如表4 所示，可見市售奶粉中的低聚果糖含量基本與標(biāo)簽值一致，只有一個(gè)奶粉的低聚果糖值與標(biāo)簽不符，其他都略高于標(biāo)簽值。

表4 10 種奶粉樣品中低聚果糖的檢測(cè)結(jié)果及標(biāo)簽值（n＝5）Table 4 Determination results and labeled values of fructo-oligosaccharides （FOS）in ten milk powder samples （n＝5）

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件和色譜分離條件，建立了奶粉中低聚果糖的高效液相色譜-四極桿／靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法避免了復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，具有分析時(shí)間短，樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定無(wú)干擾，精密度和靈敏度高，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用于實(shí)際乳粉樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法可以較好地識(shí)別出市售乳粉中的各組分低聚果糖，并能夠?qū)δ谭蹣悠分刑砑拥牡途酃沁M(jìn)行準(zhǔn)確定量。

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