吳曉剛 ， 陳孝權(quán)， 肖海軍， 劉彬球

（大益集團(tuán)勐海茶業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心實驗室，云南 勐海666200）

茶葉作為我國出口的主要經(jīng)濟作物之一，被越來越多國家的消費者所接受。目前，茶葉中農(nóng)藥殘留問題已引起廣泛關(guān)注［1］。草甘膦（glyphosate（GLY），又名鎮(zhèn)草寧、農(nóng)達(dá)等，CAS 號為1071-83-6，化學(xué)式為C3H8NO5P）［2］，1970 年由孟山都公司的化學(xué)家約翰·E·弗朗茨發(fā)現(xiàn)。它具有內(nèi)吸性，可被植物莖葉吸收向下輸導(dǎo)，能殺死多年生雜草的地下根莖，其主要影響植物的莽草酸途徑。草銨膦（glufosinate-ammonium（GLUF），又名草銨膦銨鹽，CAS 號為77182-82-2，化學(xué)式為C5H15N2O4P），由赫斯特公司開發(fā)于上世紀(jì)80 年代。它屬膦酸類除草劑，采用雜草莖葉定向噴霧處理［3］，可以隨蒸騰作用在木質(zhì)部內(nèi)向上運輸，也可以在韌皮部向地下部分運輸，是谷氨酰胺合成抑制劑。草甘膦和草銨膦均屬于廣譜、非選擇性、滅生性除草劑［4］，被廣泛施用于茶園。

歐盟和日本作為我國茶葉出口的兩大重要市場，均對茶葉制定了極為苛刻的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)［5］。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)［6］規(guī)定茶葉中草甘膦和草銨膦的最大殘留限量分別為1.0 和0.5 mg／kg。日本肯定列表制度對茶葉中草甘膦和草銨膦的最大殘留限量制定了較為嚴(yán)格的規(guī)定，分別為1.0 和0.3 mg／kg。歐盟［7］規(guī)定茶葉中草甘膦和草銨膦的最大殘留限量分別為2.0 和0.1 mg／kg。從中可看出，歐盟和日本對茶葉中草銨膦的殘留限量更為嚴(yán)格。

草甘膦和草銨膦的結(jié)構(gòu)類似，含有膦酸基、羥基、氨基，為極強的兩性化合物［3，8］。實際檢測過程中，氣相色譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)需將草甘膦和草銨膦轉(zhuǎn)化為可氣化物質(zhì)，會引入過多其他試劑，操作過程相對繁瑣［9，10］，檢測效率較低；而利用配有紫外檢測器的液相色譜儀進(jìn)行直接測定時，因草甘膦和草銨膦的分子結(jié)構(gòu)中沒有共軛雙鍵，僅存在nπ 共軛，缺少生色基團(tuán)，紫外區(qū)基本無吸收［11］。近年來發(fā)展起來的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，因具有檢測靈敏度高、適用范圍廣、分析速度快和能有效排除復(fù)雜基質(zhì)產(chǎn)生的干擾等優(yōu)點，而作為首選的最佳檢測手段。液相色譜-質(zhì)譜直接測定草甘膦和草銨膦時，儀器響應(yīng)較低，所以文獻(xiàn)報道常采用衍生技術(shù)檢測草甘膦和草銨膦殘留［12，13］。9-芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）作為常用衍生劑［14，15］，在硼酸鹽緩沖溶液中能與草甘膦和草銨膦的水提取液較好相溶，操作過程簡單，衍生產(chǎn)物的響應(yīng)信號較強，使色譜峰更容易被檢測［16］。

目前國內(nèi)外利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI MS／MS）同時檢測茶葉中草甘膦和草銨膦殘留的方法報道較少，我國目前尚無茶葉中草銨膦檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［17］中利用液相色譜-質(zhì)譜檢測茶葉中的草甘膦殘留時，實驗過程試劑耗用量大、操作步驟極多，尤其是使用陽離子交換柱（CAX）洗脫劑洗脫，加壓旋轉(zhuǎn)蒸干過程易造成草甘膦回收率不穩(wěn)定。本文對草甘膦和草銨膦的UPLC-MS／MS 檢測參數(shù)、衍生反應(yīng)最佳條件等進(jìn)行了研究，前處理采用C18固相萃取柱凈化，柱前FMOC-Cl 衍生，UPLC-MS／MS 檢測其殘留量。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；甲酸（色譜純，美國Tedia 公司）；十水四硼酸鈉和乙酸銨（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；FMOCCl（衍生級，純度≥99.0%，Aladdin Chemistry Co.，Ltd.）；草甘膦（100 mg／L，水）購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津）；草銨膦（100 mg／L，水）購自AccuStandard，Inc.。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司）；Waters XEVO TQD串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（沃特世科技有限公司）；高效粉碎機（上海嘉定糧油儀器有限公司）；臺式超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；超純水系統(tǒng)（成都康寧實驗專用純水設(shè)備廠）；漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；C18固相萃取小柱（Dikma Technologies）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、硼酸鈉溶液和衍生液的配制

草甘膦和草銨膦標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別用超純水溶解并配制成質(zhì)量濃度為10 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冰箱中避光保存。

草甘膦和草銨膦混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用超純水將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，配成含草甘膦和草銨膦均為1 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

草甘膦和草銨膦基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液：用經(jīng)提取、凈化獲得的空白茶葉基質(zhì)溶液將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，配成含草甘膦和草銨膦均為1 mg／L 的混合基質(zhì)工作溶液。

硼酸鈉溶液：稱取5.00 g 的Na2B4O7·10H2O，用超純水溶解并定容至100 mL，配制50 g／L 的硼酸鈉溶液。

FMOC-Cl 丙酮溶液：稱取2.00 g FMOC-Cl，用丙酮溶解并定容至100 mL，配制20 g／L 的FMOCCl 丙酮溶液。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC?BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；色譜柱溫度：40 ℃；進(jìn)樣室溫度：15 ℃；進(jìn)樣量：3 μL；流速：0.3 mL／min；流動相A：稱取0.154 g 無水乙酸銨溶解于適量超純水中，加入1.0 mL 甲酸，用超純水定容至1 L，0.22 μm 濾膜抽濾；流動相B：純乙腈；梯度洗脫程序：0 ～0.5 min，5% A；0.5 ～2.0 min，5% A ～95% A；2.0 ～3.5 min，95%A；3.5～4.0 min，95%A～5%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI＋；毛細(xì)管電壓：2.50 kV；離子源溫度：150 ℃；氣體：霧化氣和脫溶劑氣均為氮氣，碰撞氣為氬氣；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流速：800 L／h；數(shù)據(jù)采集：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；草甘膦特征離子對（錐孔電壓、碰撞能量）：m／z 392 ＞88（25 V、20 V）、m／z 392＞179（25 V、10 V），其中m／z 392＞88 為定量離子對；草銨膦特征離子對（錐孔電壓、碰撞能量）：m／z 404 ＞136（25 V、25 V）、m／z 404＞179（25 V、10 V），其中m／z 404＞136 為定量離子對。

1.5 樣品前處理

采樣和試樣制備：選取巴達(dá)山的毛茶空白樣品，用四分法縮減取200 g，粉碎后過1.0 mm 孔徑篩，混勻，裝入樣品盒中，備用。

提取：稱取均質(zhì)好的試樣1 g（精確至0.001 g）置于50 mL 具塞聚乙烯離心管中，加入20 mL 超純水，充分振蕩2 min，再加入二氯甲烷5 mL，混勻后超聲提取30 min，以4 500 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液待凈化。

凈化：取1.0 mL 上清液淋洗C18固相萃取小柱（事先分別用5 mL 甲醇、5 mL 超純水活化），棄去流出液；再重新加入2 mL 上清液過C18固相萃取小柱，流出液放入10 mL 玻璃離心管中，待衍生。

衍生：取1.0 mL 的凈化液，分別依次加入1.0 mL 50 g／L 硼酸鈉緩沖溶液、1.0 mL 20 g／L FMOCCl 丙酮衍生液，混勻后室溫下衍生2 h，以4 500 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min，過0.2 μm 有機微孔濾膜后，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 離子化模式及定性、定量離子對的選擇

分別用超純水配制1.0 mL 質(zhì)量濃度均為10 mg／L 的草甘膦和草銨膦標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入50 g／L 硼酸鹽緩沖溶液和20 g／L 的衍生劑溶液各1.0 mL，室溫下過夜衍生，將各單標(biāo)準(zhǔn)溶液放入進(jìn)樣器中，在梯度洗脫條件下用Waters Acquity UPLC?BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）進(jìn)行分離。在正離子模式下進(jìn)行MS2掃描，采集范圍為m／z 350～450，得到草甘膦和草銨膦的母離子峰；分別對草甘膦和草銨膦衍生物進(jìn)行子離子掃描，分別輸入已找到的母離子參數(shù)，子離子采集范圍為m／z 60 ～410，調(diào)節(jié)碰撞能量，以獲得穩(wěn)定性好、信號強度高的離子碎片。

圖1 正離子模式下GLY-FMOC 和GLUF-FMOC 的MS2 和子離子掃描光譜圖Fig.1 MS2 and daughter scan spectra of GLY-FMOC and GLUF-FMOC in positive ion mode

正離子模式下，GLY-FMOC 和GLUF-FMOC 的MS2和子離子掃描光譜如圖1 所示。錐孔電壓20 V 下，GLY-FMOC 和GLUF-FMOC 的MS2掃描中分別顯示m／z 392 和m／z 404 母離子峰；碰撞能量20 V 下，GLY-FMOC 子離子掃描顯示m／z 88、m／z 170、m／z 179 和m／z 214 等離子碎片，GLUFFMOC 子離子掃描顯示m／z 136、m／z 182、m／z 179 和m／z 208 等離子碎片。參考文獻(xiàn)［16］，選擇響應(yīng)較高的m／z 392＞88、m／z 392＞179 和m／z 404＞136、m／z 404＞179 分別作為草甘膦和草銨膦衍生產(chǎn)物的定量、定性離子對。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

通過手動調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣溫度、錐孔電壓、碰撞能量和流速等，在MRM 模式下，考察不同參數(shù)下草甘膦和草銨膦衍生物離子的信號響應(yīng)強度，從而確定其最佳質(zhì)譜采集參數(shù)。最終，選取如1.4 節(jié)所示質(zhì)譜參數(shù)。

2.2 衍生途徑及母離子裂解途徑分析

根據(jù)2.1 節(jié)中考察得到的各母離子及子離子參數(shù)，對GLY-FMOC 和GLUF-FMOC 衍生途徑及其裂解后的子離子產(chǎn)生途徑進(jìn)行分析。圖2a 顯示GLY 和GLUF 與FMOC-Cl 衍生的過程，期間GLY和GLUF 的N-H 鍵和FMOC-Cl 的C-Cl 鍵斷裂，脫去HCl。圖2b 顯示GLY-FMOC 和GLUF-FMOC均可以脫去一個CO2及其衍生前的GLY 和GLUF，而生成一個共有的m／z 179 的結(jié)構(gòu)；GLY-FMOC 和GLUF-FMOC 也可以脫去一個m／z 222 結(jié)構(gòu)，生成GLY 和GLUF 加H＋產(chǎn)物。圖2c 顯示GLY-FMOC中間產(chǎn)物m／z 170 裂解生成m／z 88；GLUF-FMOC裂解生成m／z 208，其中間產(chǎn)物m／z 182 裂解生成m／z 136。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇

Waters Acquity UPLC?BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）采用1.7 μm 小顆粒填料在更寬的線速度范圍內(nèi)可獲得最佳的柱效，能顯著提升色譜柱的性能［18］。眾多研究型文獻(xiàn)對利用C18色譜柱分離草甘膦和草銨膦均有較全面的報道。林永輝等［3］曾利用Kinetex C18色譜柱對茶葉中的草銨膦進(jìn)行分離、確證（柱前衍生），平均回收率為61.6%～81.4%，LOD 值為0.03 mg／kg；曹趙云等［19］曾利用Zorbax Extend C18色譜柱對稻米中的草甘膦進(jìn)行定性、定量分析（柱前衍生），平均回收率為85.0%～113.6%，LOD 值為0.002 mg／kg。

2.3.2 流動相的優(yōu)化

配制以下4 組流動相：（Ⅰ）A 為乙腈，B 為0.154 g 無水乙酸銨溶于1 L 超純水中，其中加入1 mL 甲酸；（Ⅱ）A 為乙腈，B 為0.1%（v／v）甲酸水溶液；（Ⅲ）A 為50%（v／v）甲醇乙腈，B 為0.1%（v／v）甲酸水溶液；（Ⅳ）A 為甲醇，B 為0.1%（v／v）甲酸水溶液?？疾觳莞熟⒑筒蒌@膦在使用上述各組流動相梯度洗脫條件下的色譜行為。實驗結(jié)果顯示：流動相Ⅰ出峰效果最好；Ⅱ中分析物有明顯的峰拖尾現(xiàn)象；含有甲醇的流動相（Ⅲ和Ⅳ）出峰時間延后。故本實驗選取流動相Ⅰ，其流動相中的甲酸可提供H＋，能維持目標(biāo)離子質(zhì)子化狀態(tài)，增強目標(biāo)分析物在流動相中的離子化程度，有助于提高檢測效率；銨鹽可以改善樣品峰形，使峰形更對稱。

2.4 衍生條件的優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度為20、30、40、50、60 g／L 的硼酸鈉緩沖溶液，及質(zhì)量濃度為1、5、10、20、30 g／L 的FMOC-Cl 丙酮溶液，做二者對草甘膦和草銨膦的衍生效果影響試驗。當(dāng)硼酸鈉緩沖溶液質(zhì)量濃度為50 g／L 和FMOC-Cl 丙酮溶液質(zhì)量濃度為20 g／L時，衍生效果最佳。在50 g／L 硼酸鈉緩沖溶液和20 g／L FMOC-Cl 丙酮溶液下，進(jìn)行衍生時間分別為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 h 的條件試驗，發(fā)現(xiàn)衍生時間為2 h 時，衍生反應(yīng)已達(dá)到平衡。

2.5 方法檢出限及基質(zhì)效應(yīng)評定

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）主要來源于色譜分離過程中與待測物共流出的干擾物質(zhì)（包括內(nèi)源性組分和外源性組分）對待測物離子化效率的影響。內(nèi)源性組分是指茶葉樣品提取過程中被同時提取出來的有機或無機分子（如無機鹽、酚類、色素和脂類等）。茶葉中復(fù)雜的內(nèi)源性基質(zhì)因茶種類的不同而有所區(qū)別，例如綠茶、紅茶、烏龍茶和普洱茶［20］。而外源性組分主要是由前處理過程引入，包括衍生反應(yīng)時引入的緩沖鹽、衍生劑及其溶解液等。

為分析茶葉內(nèi)源基質(zhì)和衍生反應(yīng)對草甘膦和草銨膦產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)，準(zhǔn)備如下兩組實驗：（A）將草甘膦和草銨膦用超純水配制成質(zhì)量濃度為0.009 375、0.018 75、0.075、0.15 和0.3 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個濃度樣品取1.0 mL，依次加入1.0 mL 50 g／L 硼酸鈉緩沖溶液和1.0 mL 20 g／L衍生劑溶液，衍生2 h；（B）將草甘膦和草銨膦用空白基質(zhì)液稀釋成0.009 375、0.018 75、0.075、0.15和0.3 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個濃度樣品取1.0 mL，依次加入1.0 mL 50 g／L 硼酸鈉緩沖溶液和1.0 mL 20 g／L 衍生劑溶液，衍生2 h 后進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度（X，mg／L）為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積（Y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表1 可見，各標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.990，相關(guān)性良好。在信噪比（S／N）為3 時計算檢出限（LOD），S／N 為10 時計算定量限（LOQ），結(jié)果見表1。0.025 mg／L GLY-FMOC 和GLUF-FMOC 混合純水標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖3。

圖2 （a）GLY 和GLUF 的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其衍生反應(yīng)過程、（b）GLY-FMOC 和GLUF-FMOC 的共有裂解途徑和（c）GLY-FMOC 和GLUF-FMOC 各自特有的裂解途徑Fig.2 （a）Chemical structures of GLY and GLUF，and derivatization reaction with FMOC-Cl，（b）common fragmentation pathway for the two derivatives and （c）specific fragmentation pathways for GLU-FMOC and GLUF-FMOC

基質(zhì)效應(yīng)可以用ME ＝B／A×100%計算，式中B為基質(zhì)曲線斜率，A 為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。一般情況下，ME 在85%～115%之間不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。據(jù)此判斷，本檢測方法對草甘膦和草銨膦基質(zhì)效應(yīng)不顯著（見表1）。

表1 草甘膦和草銨膦標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)（ME）Table 1 Linear equations，correlation coefficients （r）and matrix effects （ME）of GLY and GLUF standard solutions and matrix-matched standard solutions

圖3 GLY-FMOC 和GLUF-FMOC 標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.025 mg／L）的色譜圖Fig.3 Chromatograms of GLY-FMOC and GLUF-FMOC standard solutions at 0.025 mg／L

2.6 方法的回收率、精密度及其穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取1 g 勻質(zhì)好的空白茶樣于50 mL 離心管中，分別添加草甘膦和草銨膦各0.375、1.500 和4.500 mg／kg，每個添加濃度重復(fù)6 次，按照1.5 節(jié)所述進(jìn)行處理后進(jìn)樣。由表2 可見，3 個添加水平下，草甘膦平均回收率為87.37%～99.11%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n ＝6）為0.68%～1.35%；草銨膦平均回收率為81.44% ～86.17%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n ＝6）為1.01%～2.33%。取一份處理好的加標(biāo)1.500 mg／kg 溶液，在進(jìn)樣室內(nèi)放置，每隔4 h測定一次，結(jié)果測得草甘膦和草銨膦定量離子峰面積的RSD 分別為2.65%和4.01%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表2 茶葉中2 種農(nóng)藥的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of the two pesticides spiked in tea（n＝6）

2.7 實際樣品的測定

利用本檢測方法對來自云南省普洱茶主產(chǎn)區(qū)的39 份茶樣原料、11 份市售綠茶樣本和7 份市售紅茶樣本進(jìn)行草甘膦和草銨膦殘留量的測定。結(jié)果顯示，草甘膦和草銨膦均未檢出。

3 結(jié)語

本方法通過用超純水和二氯甲烷作為提取溶劑較好地去除茶葉中脂溶性色素等物質(zhì)，C18固相萃取小柱凈化，優(yōu)化UPLC-MS／MS 儀器條件，建立了柱前衍生-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定茶葉中草甘膦和草銨膦兩種農(nóng)藥殘留量的檢測方法。本方法凈化過程簡單，檢測速度快，可作為茶葉中草甘膦和草銨膦殘留量的分析確證方法。

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