李亞東，吳名草，金邦荃

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

豬心肌高鐵肌紅蛋白分子結(jié)構(gòu)解析

李亞東，吳名草，金邦荃*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

本研究分別運用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）、紫外光譜、氨基酸分析、質(zhì)譜和分子信息技術(shù)，比較中國山豬心肌高鐵肌紅蛋白（pig metmyoglobin，pMetMb）分子信息和三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：pMetMb肽鏈至少含有133 種氨基酸組分，但較hMb缺少脯氨酸（Pro）和精氨酸（Arg）；與美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫豬野生型gi|494385比對，其匹配度79.7%（置信度100%），故推測肽鏈長度在133～153之間。pMetMb含有7 個α螺旋和2 個310螺旋，由于310螺旋存在（馬Mb沒有），使肽鏈中疏水基團作用加強，形成更加緊密盤疊的球狀亞基；第6和7螺旋的His64和His93的咪唑基團N（Im N—）與Fe2+/Fe3+鍵合，構(gòu)成核心heme-Fe功能域；它鑲嵌于蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)內(nèi)，更便于電子傳遞和Fe2+/Fe3+氧化還原反應(yīng)，維系肉色。

高鐵肌紅蛋白；氨基酸種類；α螺旋；分子結(jié)構(gòu)信息；豬心肌

肉色作為肉品品質(zhì)的重要質(zhì)量和經(jīng)濟指標之一，也是消費者購買肉及肉制品的首要參考因素[1-4]。宰后生鮮肉的色澤主要由肌細胞內(nèi)肌紅蛋白（myoglobin，Mb）的含量及其氧化還原狀態(tài)決定[2-3]。Mb廣泛存在于脊柱動物的心肌和骨骼肌細胞，有3 種存在形式，即Mb、氧合肌紅蛋白（myoglobin-O2，MbO2）和高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）[4]。三者不斷進行氧化還原反應(yīng)，相互轉(zhuǎn)化，從而維系畜肉理想的鮮紅色[2-3,5-12]。

隨著對肉色研究的深入，大部分研究者并未對影響肉色的Mb的分子信息和結(jié)構(gòu)特征做出較好的闡釋[2-3,5-7]。為此經(jīng)過10余年的科研工作，本課題組從中國山豬心肌中成功分離純化出了高鐵肌紅蛋白（pMetMb）[13-14]，希望通過對其分子信息和化學(xué)結(jié)構(gòu)的深入研究，探究其影響豬肉色穩(wěn)定性的分子生物學(xué)機理，為進一步的肉色及護色等相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬心肌肌紅蛋白（horse myoglobin，hMb）：棕紅色粉末，純度為90.0%，購于美國Sigma公司，為參照。豬心肌高鐵肌紅蛋白（pig metmyoglobin，pMetMb）：棕紅色粉末，純度≥93.0%，南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院功能性食品實驗室制備[13-14]。

α-腈基-4-羥基苯丙烯酸（純度≥95.0%） 美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸、碘乙酰胺（均為色譜純）德國Merck公司；胰蛋白酶（Trypsin）（質(zhì)譜純） 美國Promega公司；考馬斯亮藍R-250 美國Amresco公司；蛋白質(zhì)Marker、丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（29∶1，m/m，分析純） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer質(zhì)譜儀美國ABI公司；GelDoc 2000成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；UV-6100A紫外分光光度計 上海安銳自動化儀表有限公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 2 種Mb紫外和電泳定性

0.2 mol/L pMetMb和hMb水溶液置于紫外-可見分光光度計下190～900 nm波長范圍內(nèi)掃描，檢測其特征峰波長[15]；以14.4、20.0、31.0、45.0、66.2、98.0 kD蛋白質(zhì)標準品為基準，將純化后pMetMb于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）100 V、2～3 h條件下電泳（5%濃縮膠、12%分離膠、考馬斯亮藍R-250染色后脫色）并成像，得到其表觀分子質(zhì)量[13-14]；重復(fù)6 次。

1.3.2 2 種Mb氨基酸組分及比對

參照GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測定》，分別將2 種Mb按1∶1（m/V）溶于6 mol/L HCl，110 ℃條件下至完全消化，用全自動氨基酸分析儀檢測2 種Mb酸解氨基酸組分（amino acids，AAs），計算AAs種類、數(shù)量和百分比并進行2 種Mb間的比對[16]。

1.3.3 pMetMb分子結(jié)構(gòu)信息解析

pMetMb裂解：將pMetMb按1∶5（m/V）溶于10 mg/mL胰蛋白酶液中，于37 ℃水浴20 h，之后加入100 μL 60%乙腈-0.1%三氟乙酸15 min超聲并于－83 ℃凍干后備用。

pMetMb一級結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析：質(zhì)譜儀工作條件：200 Hz/355 nm Nd-YAG激光器、2 kV加速電壓及碰撞能量、800～4 000 D肽指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF）質(zhì)量掃描區(qū)域、信噪比大于50母離子、2 500 次激發(fā)二級質(zhì)譜（mass spectrometry/mass spectrometry，MS/MS）、正離子模式自動采集數(shù)據(jù)；NCBI-SUS scrofa數(shù)據(jù)庫、MS+MS/MS的Masot軟件聯(lián)合檢索。

pMetMb裂解液凍干粉復(fù)溶于2 μL體積分數(shù)20%乙腈，取1 μL復(fù)溶液點于不銹鋼靶板（384 孔）并自然干燥，再滴加0.5 μL過飽和α-腈基-4-羥基苯丙烯酸基質(zhì)溶液（50%乙腈-0.1%三氟乙酸）并自然干燥，之后置于4800基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間二級質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization time of flight/ionization time of flight-MS，MALDI TOF/TOF-MS），進行小片段肽鏈的氨基酸序列解析[17]。

1.3.4 2 種Mb分子結(jié)構(gòu)信息比對

2 種Mb氨基酸序列同源性和差異性，采用美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫及其中NCBI-BLASTp計算軟件進行計算[18]；且在PDB數(shù)據(jù)庫中，運用pyMOL軟件推演并顯示pMetMb二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMetMb和hMb的化學(xué)態(tài)分析

經(jīng)紫外全程掃描，pMetMb和hMb均在409 nm波長處的Mb特征區(qū)域呈現(xiàn)蛋白質(zhì)特征峰，故同屬哺乳類Mb（圖1）；不論是否采用K3Fe(CN)6氧化hMb，hMb、hMb+K3Fe(CN)6和pMetMb的特征峰高度重合，其中hMb和hMb+K3Fe(CN)6峰高和出峰時間高度一致，說明hMb實質(zhì)為馬心肌高鐵肌紅蛋白（horse metmyoglobin，hMetMb），可與pMetMb進行同類化合物分子信息和結(jié)構(gòu)的比較[19]。在前人研究的基礎(chǔ)上可知[20-21]，409 nm是MetMb紫外特征吸收波長，而MbO2的紫外特征吸收波長則在420、540、580 nm左右處，Mb在430、560 nm左右處。由此可鑒定所獲得蛋白質(zhì)的MetMb化學(xué)態(tài)歸屬，因此本實驗制備的豬心肌pMetMb確實歸屬于氧化態(tài)的MetMb。

SDS-PAGE法測得pMetMb表觀分子質(zhì)量為17 kD，而hMb分子質(zhì)量為16.9 kD[22-23]（圖2）。眾所周知，Mb在長期進化中具有高度穩(wěn)定性和傳承性，尤其在高等哺乳類動物中，心肌源的Mb在分子質(zhì)量上高度接近，差異不足4%[18,23-24]。

從hMb和pMetMb水溶液電泳和紫外掃描結(jié)果判斷：二者均為單條帶的單一肽鏈蛋白質(zhì)，409 nm波長處呈現(xiàn)紫外特征光譜，均屬于氧化態(tài)Mb，即MetMb，故hMb可作為本研究參照物。

圖1 pMetMb和hMb紫外光譜Fig.1 UV spectra of pMetMb and hMb

圖2 pMetMb的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of pMetMb

2.2 2 種MetMb氨基酸組分

2.2.1 氨基酸種類的比較

表1 2種MetMb氨基酸組成Table 1 Amino acid comparison of two MetMbs

由表1、圖3可知，2 種MetMb鹽酸水解后，揭示出pMetMb和hMetMb分別由15、17 種AAs組成；其中pMetMb AAs與hMetMb相比缺失脯氨酸（Pro）和精氨酸（Arg）；經(jīng)比對，2 種蛋白質(zhì)AAs種類同源性高達88.2%，差異僅為11.8%，符合同源蛋白質(zhì)基本規(guī)律；因物種進化，馬屬于哺乳類動物中的草食動物，而豬屬于雜食動物，在早期物種分化上早已分支，它們心肌Mb/MetMb的AAs種類從而發(fā)生了微小改變，并具備了各自物種的特征[23-24]。

圖3 hMetMb（a）和pMetMb（b）的氨基酸組分Fig.3 Amino acid composition of hMetMb (a) and pMetMb (b)

2.2.2 氨基酸比例的比較

根據(jù)組分中每一氨基酸的峰高和半峰寬計算其所占總數(shù)比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 種MetMb中17 種AAs比例不盡相同，其中pMetMb AAs組分缺少Pro和Arg，其比例分別記為0%，因此pMetMb和hMetMb中這兩種氨基酸比例差異達100%；比較其他15 種AAs，對應(yīng)的比例均不相同，存在不同程度的差異（表1，圖3）。

經(jīng)分析，二者均有8 種AAs比例超過5%。pMetMb組分中His比例最高，達到18.99%；hMetMb中Lys最高，達到14.95%，其次是12.73% Glu和12.44% Leu。比較后注意到，hMetMb中Lys比例幾乎是pMetMb的2 倍，而Cys+ Met比例則明顯低于pMetMb（表1，圖3）。

對2 種MetMb中17 種AAs所占比例進一步分析，僅Pro、Arg、Phe、Met、Cys、Gly和Ile 7 種AAs的比例差異較大，平均73.73%；Tyr無差異；其他AAs比例差異都在50%以下，其中僅Ser和Ala差異在20%以下，分別為10.92%和6.75%。經(jīng)加權(quán)分析（AAs種類差異性/%= {[（1.74+6.05）×55.33+（2.12+2.64）×10.92+（6.15+7.04）×6.75+（1.82+4.32）×40.72+（7.90+ 3.50）×38.60+（1.42+4.78）×54.19+（6.26+12.44）× 33.05+（2.27+2.27）×0+（0+4.12）×100+（5.45+1.19）×64.16+（0+1.61）×100+（0.19+ 1.09）×70.31+（7.12+12.73）×28.26+（3.61+7.21）× 33.27+（7.43+14.95）×33.60+（7.43+6.43）×72.15+（18.99+10.54）×28.61+（2.97+1.71）×26.92] /（2×17×104）}×100），2 種MetMb AAs比例的同源性為98.1%，差異性僅為1.9%，屬于高度同源的蛋白質(zhì)。

2.3 2 種MetMbs肽鏈氨基酸序列解析與比較

2.3.1 pMetMb氨基酸序列解析

酶解pMetMb經(jīng)MALDI TOF質(zhì)譜累積掃描25 次，得到一級質(zhì)譜的肽指紋圖譜。由圖4可知，800～4 000 D范圍內(nèi)共有137 個肽片段；進一步縮小分子質(zhì)量范圍，800～2 000 D含有104 個肽片段，2 000～3 000 D中有21 個肽片段，而3 000～4 000 D中僅含12 個肽片段，該蛋白質(zhì)酶解后肽鏈AAs片段主要集中在800～2 000 D，占總數(shù)的76%。

圖4 MALDI-TOF質(zhì)譜pMetMb離子峰Fig.4 Peptide ions of pMetMb in MALDI TOF mass spectrum

選取一級質(zhì)譜中峰型好、強度高的離子峰片段，高能量（2 kV）碰撞誘導(dǎo)肽片段進一步裂解（collisioninduced dissociation，CID），并用MALDI TOF/TOF二級質(zhì)譜累積掃描2 500 次，從而獲得8 個二級質(zhì)譜的肽碎片指紋圖譜（peptide fragment fingerprinting，PFF），即8 個氨基酸序列小片段。根據(jù)pMetMb的PMF結(jié)合其8 個PFF，在NCBI數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)豬源子庫（gi）進行搜索和比對，僅得到PMF中m/z 1 955.268 6及8 個PFF中m/z 1 393.990 6、1 488.850 5、1 593.070 1和1 827.156 6這5 片段精確氨基酸排序，一級結(jié)構(gòu)與gi|494385匹配最近，725 分Mascot，置信度100%，匹配度79.7%（圖5，表2）。

圖5 MALDI TOF/TOF質(zhì)譜pMetMb離子峰Fig.5 Peptide ions of pMetMb by MALDI TOF/TOF mass spectrometry

表2 pMetMb肽鏈AAs序列NCBI數(shù)據(jù)庫檢索Table 2 Peptide sequence alignment of pMetMb in NCBI

pMetMb 5 片段氨基酸序列依次命名為A、B、C1、C2和D片段（圖6），分別起始于17～31位（15 AAs）、64～77 位（14 AAs）、80～96 位（17 AAs）、79～96 位（18 AAs）和119～133 位（15 AAs）。

研究發(fā)現(xiàn)，其中C2片段在N端比C1片段多一位Lys；同時在m/z 2 083.396 2 處的一級質(zhì)譜解讀到另一離子峰，與數(shù)據(jù)庫gi|494385比對，該片段可能是19 AAs多肽，且在N端再增加一位K，因此其肽鏈AAs序列推測為KKGHHEAELTPLAQSHATK，且指認為C3片段。pMetMb肽鏈可任意在第80位、第79位或第78位Lys處被Trypsin水解或剪切，形成C1、C2和C3片段，只是分子質(zhì)量或AAs序列略有不同（圖4，圖6），符合前人推理[25]。由此表明，本實驗室制備的pMetMb肽鏈AAs序列至少含有133 AAs，與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫豬子庫中g(shù)i|494385豬野生型Mb/MetMb分子信息高度同源，故pMetMb肽鏈AAs的一級結(jié)構(gòu)歸屬于豬種MetMb。

研究進一步分析了B和C片段AAs序列（圖6），發(fā)現(xiàn)第64位（B片段）和93位（C片段）的His在蛋白質(zhì)α螺旋過程中，2 His所在咪唑基團（Imidazole，Im）高度接近，可能是構(gòu)成heme的基礎(chǔ)。其中N—可與Fe2+/Fe3+形成配位，不斷由6配位低自旋（heme-Fe3+）轉(zhuǎn)化為5配位高自旋（heme-Fe2+），通過電子傳遞攜帶O2，營養(yǎng)肌肉組織，以維系肉色穩(wěn)定[2-3]。經(jīng)紫外光譜證實：在409 nm波長處存在heme-Fe3+結(jié)構(gòu)特征峰（圖1），佐證了在B和C片段處形成heme環(huán)狀結(jié)構(gòu)的可能性。

圖6 MetMb肽鏈氨基酸序列Fig.6 Amino acid sequences in 2 MetMb

2.3.2 2 種MetMbs氨基酸同位置換及差異

根據(jù)蛋白質(zhì)NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，得到一高度同源的豬野生型Mb/MetMb（gi|494385）和馬心肌Mb/MetMb（gi|157834316）分子信息，它們肽鏈均為153 AAs。由本實驗室制備的pMetMb其MALDI TOF/TOF質(zhì)譜得到的結(jié)果，它的分子信息與豬野生型gi|494385高度匹配，因此本實驗以豬gi|494385和馬gi|157834316進行物種間AAs序列比對。

2 種MetMbs比對（BLASTp）后發(fā)現(xiàn)，AAs序列中有14 位點同位置換，分別在第9位（Leu/Gln）、第21位（Val/Ile）、第34位（Lys/Thr）、第51位（Ser/Thr）、第53位（Asp/ Ala）、第66位（Asn/Thr）、第67位（Thr/Val）、第87位（Thr/Lys）、第101位（Val/Ile）、第109位（Glu/Asp）、第113位（Gln/His）、第116位（Gln/His）、第132位（Ser/Thr）和第142位（Met/Ile），其物種間差異僅為9.2%（圖6）。

進一步統(tǒng)計2 種MetMbs肽鏈中相同AAs個數(shù)，其中7 種AAs（Gly、Tyr、Pro、Cys、Arg、Asp和Phe）個數(shù)完全一致，另5 種AAs（Ala、Val、Leu、Glu和Lys）個數(shù)達到98.8%，僅Ser、Thr、His、Ile和Met 5 種AAs個數(shù)差異較大（表3）。

表3 2種MetMb肽鏈的氨基酸個數(shù)Table 3 Number comparison of amino acids between two MetMb

本研究分析表明，Mb/MetMb是高度進化的蛋白質(zhì)，尤其在高等哺乳類動物間，豬和馬的同源性可高達90.8%。

2.4 pMetMb高級結(jié)構(gòu)解析

2.4.1 二級結(jié)構(gòu)解析

NCBI數(shù)據(jù)庫中pMetMb與豬野生型Mb/MetMb（gi|494385）的AAs序列比對，二者匹配度79.7%，為高度同源蛋白質(zhì)。

MALDI TOF/TOF得到的pMetMb 4/5典型小肽片段，經(jīng)PDB二級結(jié)構(gòu)解析，解讀出pMetMb具有7 個α螺旋和2 個310螺旋共9 個螺旋結(jié)構(gòu)。A、B、C1/C2和D小肽片段分別構(gòu)成第2螺旋、第6螺旋、第7螺旋和第9螺旋N端部分區(qū)域，還包括第6、7螺旋和第8、9螺旋間的無規(guī)卷曲。

文獻指出，其他大多數(shù)哺乳類動物，如抹香鯨或馬，肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)僅有8 個α螺旋[4,26]；但豬的第3螺旋結(jié)構(gòu)被分裂成2 個310螺旋，即形成第3和第4螺旋[27]。由于310螺旋更緊密，片段更短，更有利于肽鏈三級結(jié)構(gòu)的形成。本實驗前期采用光譜學(xué)手段，指認pMetMb二級結(jié)構(gòu)，其α螺旋結(jié)構(gòu)可高達50%，屬于高度螺旋的球狀蛋白質(zhì)[28-29]。

由于第6和7螺旋在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，二螺旋間的無規(guī)卷曲形成疏水間隙，heme-Fe鑲嵌其中，heme-Fe兩側(cè)的His64和His93通過咪唑環(huán)N—與Fe2+/Fe3+形成配位結(jié)構(gòu)，其作用力使二螺旋間的無序卷曲發(fā)生彎曲，從而導(dǎo)致第6和第7螺旋空間結(jié)構(gòu)進一步相向接近，更有利于Fe2+和Fe3+電子傳遞，從而構(gòu)成Mb/MetMb核心結(jié)構(gòu)功能域[4,27,30]。

2.4.2 三級空間結(jié)構(gòu)推演

圖7 pMetMb空間結(jié)構(gòu)Fig.7 Spatial structure of pMetMb

采用pyMOL軟件，推演pMetMb三級空間結(jié)構(gòu)。由于該蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)可形成7 個α螺旋和2 個310螺旋，螺旋與螺旋間在側(cè)鏈基團（H—H，S—S等）的非極性鍵作用下，緊密盤曲折疊，形成球狀結(jié)構(gòu)（圖7A）；在第6和7螺旋間形成內(nèi)部狹窄的疏水間隙，即在球蛋白質(zhì)分子表面出現(xiàn)凹陷區(qū)域，官能團heme-Fe鑲嵌于此（圖7B）。

3 結(jié) 論

通過對pMetMb較hMetMb中AAs組分的解析、計算和比對，pMetMb較hMetMb缺失Pro和Arg，且AAs比例和個數(shù)不盡相同。但它們種類同源性達88.2%，比例和個數(shù)分別為98.1%和90.8%，證明二者AAs組分高度同源。

一級結(jié)構(gòu)測序說明pMetMb肽鏈至少含有133 種AAs；經(jīng)將5 個重點小肽片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中豬野生型gi|494385精確比對，其79.7%匹配度（置信度100%）證明研究獲得的pMetMb屬于豬源MetMb，而推測出pMetMb肽鏈中AAs序列長度在133～153之間。

pMetMb的二、三級結(jié)構(gòu)含有7 個α螺旋和2個310螺旋，且螺旋間存在部分無規(guī)卷曲；由于310螺旋存在，二級結(jié)構(gòu)中疏水基團更易相互作用，形成緊密折疊的球狀亞基。

pMetMb肽鏈His64和His93分別位于第6和第7螺旋，2 His Im N－形成內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)，與Fe2+/Fe3+鍵合后構(gòu)成核心功能域，導(dǎo)致heme-Fe2+/Fe3+官能團鑲嵌于此，更便于電子傳遞和Fe2+/Fe3+氧化還原反應(yīng)，以維系理想肉色。

[1] QUEVEDO R, VALENCIA E, CUEVAS G, et al. Color changes in the surface of fresh cut meat: a fractal kinetic application[J]. Food Research International, 2013, 54(2): 1430-1436.

[2] MANCINI R A, HUNT M C. Current research in meat color[J]. Meat Science, 2005, 71(1): 100-121.

[3] BEKHIT A E D, FAUSTMAN C. Metmyoglobin reducing activity[J]. Meat Science, 2005, 71(3): 407-439.

[4] HENGGEN-COTTA U B, KELM M, RASSAF T. Myoglobin functions in the heart[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2014, 73: 252-259.

[5] 王瑋, 湯祥明, 金邦荃. 高鐵肌紅蛋白含量和高鐵肌紅蛋白還原酶活性與冷鮮肉肉色穩(wěn)定性關(guān)系的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 94-97.

[6] MIKKELSEN A, JUNCHER D, SKIBSTED L H. Metmyoglobin reductase activity in porcine m. longissimus dorsi muscle[J]. Meat Science, 1999, 51(2): 155-161.

[7] JACOB R H, D’ANTUONO M F, GILMOUR A R, et al. Phenotypic characterisation of colour stability of lamb meat[J]. Meat Science, 2014, 96(2): 1040-1048.

[8] BEKHIT A E D, GEESINK G H, ILIAN M A, et al. The effects of natural antioxidants on oxidative processes and metmyoglobin reducing activity in beef patties[J]. Food Chemistry, 2003, 81(2): 175-187.

[9] BEKHIT A E D, GEESINK G H, ILIAN M A, et al. Particulate metmyoglobin reducing activity and its relationship with meat color[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(20): 6026-6035.

[10] SAMMEL L M, HUNT M C, KROPF D H, et al. Comparison of assays for metmyoglobin reducing ability in beef inside and outside semimembranosus muscle[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(3): 978-984.

[11] 白鳳霞, 孔保華, 戴瑞彤. 肉類顏色的影響因素研究[J]. 肉類研究, 2009, 23(4): 15-19.

[12] BEKHIT A E D, GEESINK G H, MORTON J D, et al. Metmyoglobin reducing activity and colour stability of ovine longissimus muscle[J]. Meat Science, 2001, 57(4): 427-435.

[13] 湯祥明, 金邦荃, 劉興余. 豬心肌高鐵肌紅蛋白的提取和純化[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2006, 38(7): 34-36.

[14] 湯祥明, 金邦荃, 劉興余. 從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白的方法:中國, 200610037909.X[P]. 2008-01-25.

[15] BANERJEE S, CHAKRABORTI A S. Structural alterations of hemoglobin and myoglobin by glyoxal: a comparative study[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 66: 311-318.

[16] GB/T 18246—2000 飼料中氨基酸的測定[S].

[17] DOSI R, CARUSONE A, CHAMBERY A, et al. Rapid primary structure determination of myoglobins by a complementary approach based on mass spectrometry and Edman degradation[J]. Food Chemistry, 2012, 133(4): 1646-1652.

[18] JOSEPH P, SUMAN S P, LI Shuting, et al. Amino acid sequence of myoglobin from white-tailed deer (Odocoileus virginianus)[J]. Meat Science, 2012, 92(2): 160-163.

[19] SMERDON S J, KRZYWDA S, BRZOZOWSKI A M, et al. Interactions among residues CD3, E7, E10, and E11 in myoglobins: attempts to simulate the ligand-binding properties of Aplysia myoglobin[J]. Biochemistry, 1995, 34(27): 8715-8725.

[20] KUMAR A, VENKATESU P. A comparative study of myoglobin stability in the presence of Hofmeister anions of ionic liquids and ionic salts[J]. Process Biochemistry, 2014, 49(12): 2158-2169.

[21] BHATTACHERJEE A, CHAKRABORTI A S. Fructose-induced modifications of myoglobin: change of structure from met (Fe3+) to oxy (Fe2+) form[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 48(1): 202-209.

[22] di GIUSEPPE A M A, GIARRETTA N, LIPPERT M, et al. An improved UPLC method for the detection of undeclared horse meat addition by using myoglobin as molecular marker[J]. Food Chemistry, 2015, 169(15): 241-245.

[23] GIARETTA N, di GIUSEPPE A M A, LIPPERT M, et al. Myoglobin as marker in meat adulteration: a UPLC method for determining the presence of pork meat in raw beef burger[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 1814-1820.

[24] JOSEPH P, SUMAN S P, LI Shuting, et al. Primary structure of turkey myoglobin[J]. Food Chemistry, 2011, 129(1): 175-178.

[25] 王勇, 李水明, 何曼文. 基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜鑒定鯊魚硒結(jié)合蛋白[J]. 質(zhì)譜學(xué)報, 2013, 34(5): 257-262.

[26] EVANS S V, BRAYER G D. High-resolution study of the threedimensional structure of horse heart metmyoglobin[J]. Journal of Molecular Biology, 1990, 213(4): 885-897.

[27] OLDFIELD T J, SMERDON S J, DAUTER Z, et al. High-resolution X-ray structures of pig metmyoglobin and two CD3 mutants: Mb (Lys45. fwdarw. Arg) and Mb (Lys45. fwdarw. Ser)[J]. Biochemistry, 1992, 31(37): 8732-8739.

[28] 吳名草, 金邦荃, 陳許明, 等. 紫外照射下高鐵肌紅蛋白變化的同步熒光光譜指認[J]. 激光與光電子學(xué)進展, 2013, 50(5): 197-203.

[29] 吳名草, 金邦荃, 陳許明, 等. 豬心肌高鐵肌紅蛋白分子動力學(xué)結(jié)構(gòu)功能域的熒光光譜指認[C]//全國動物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編, 2012.

[30] SHIKAMA K. Nature of the FeO2bonding in myoglobin and hemoglobin: a new molecular paradigm[J]. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 2006, 91(1/2): 83-162.

Structural Elucidation of Metmyoglobin in Pig Myocardium

LI Yadong, WU Mingcao, JIN Bangquan*
(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

The structural elucidation of metmyoglobin (Mb) is helpful for understanding the mechanism of meat color. Molecular information and three-dimensional structure of metmyoglobin (pMetMb) in pig myocardium were studied by SDS-PAGE, UV spectroscopy, amino acid analysis, mass spectrometry and bioinformatics. The peptide chain of pMetMb was composed of at least 133 amino acids (AAs). AAs from pMetMb lacked proline (Pro) and arginine (Arg) compared with horse Mb (hMb). pMetMb was matched 79.7% (100% confidence) with gi|494385 in NCBI database, suggesting that the length of pMetMb peptide was in the range of 133-153 AAs including 7 α-helixes and 2 310helixes in its secondary structure. Due to the 310helixes, hydrophobic groups in pMetMb had increased interaction with each other and the peptide chain highly folded as globin subunit, while hMb contained no 310helixes. Both His64 and His93 located at the 6thα-helix and 7thα-helix contained imidazole group with nitrogen (N-) that could bind with Fe2+/Fe3+to form heme-Fe domain which was embed into hydrophobic groups, facilitating electron transfer and oxidation-reduction and consequently for maintaining desirable meat color.

metmyoglobin (MetMb); amino acids; alpha helix; molecular and structural information; pig myocardium

TS251

A

1002-6630（2015）21-0062-06

10.7506/spkx1002-6630-201521013

2015-01-05

江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK2009402）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目（CX（11）1301）

李亞東（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品肉品學(xué)。E-mail：ns_liyadong@163.com

*通信作者：金邦荃（1956—），女，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：jinbangquan@njnu.edu.cn