劉天囡，徐夢佳，胡 冰，費群勤，徐冬蘭，曾曉雄

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶活性的抑制作用

劉天囡，徐夢佳，胡 冰，費群勤，徐冬蘭，曾曉雄*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

以湖南茯磚茶為原料通過熱水浸提、樹脂吸附分離得到茯磚茶多酚類物質(zhì)，并采用酶動力學(xué)和熒光猝滅分析方法探討了茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制作用。結(jié)果表明：茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶有抑制作用，半抑制濃度（IC50）為0.81 mg/mL，抑制類型為可逆非競爭性抑制，其抑制常數(shù)Ki為2.56 mg/mL。熒光光譜分析表明茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶具有熒光猝滅效應(yīng)，與茯磚茶多酚類物質(zhì)的結(jié)合可能造成了酶結(jié)構(gòu)的改變，從而降低了酶的催化活性。

茯磚茶；多酚；胰脂肪酶；抑制作用

自古以來茶葉是備受人們喜愛的飲品之一，其與人們的生活息息相關(guān)。隨著人們生活水平的提高，茶葉的降血脂[1-3]、降血壓[4-6]、抗動脈粥樣硬化[7]等多種生物活性也日益得到重視。黑茶屬于我國六大茶類之一，是后發(fā)酵茶，也是我國特有的茶類。黑茶中含有多種活性物質(zhì)，其中茶多酚為主要活性成分，約占黑茶干質(zhì)量的10%～30%[8-9]。張忠[10]的研究表明茶多酚具有抑制胰脂肪酶活性的作用，也有研究發(fā)現(xiàn)黑茶可以顯著降低膽固醇水平、甘油三酯含量和血清脂蛋白含量[11]。

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一類特殊的酯基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯[12]。胰脂肪酶是脂肪水解過程中的關(guān)鍵酶，抑制胰脂肪酶的活性可有效抑制脂肪的水解和吸收，達到控制和治療肥胖的目的。如朱曉青等[13]報道荷葉中的生物堿是胰脂肪酶的非競爭抑制劑，邊金霖等[14]發(fā)現(xiàn)雅安藏茶具有抑制胰脂肪酶的作用，綠茶和白茶中的茶多酚能夠有效地抑制胰脂肪酶的體外活性，對控制肥胖起到較好的效果[15]。因此，探究茯磚茶中多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶活性的影響，進一步闡述茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制作用機理，對探討其降脂作用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

特制茯磚茶 湖南中茶茶業(yè)有限公司。

聚酰胺樹脂 無錫臨江化學(xué)試劑廠；無水乙醇、Na2CO3、乙酸鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 南京化學(xué)試劑股份有限公司；豬胰脂肪酶（TypeⅡ） 美國Sigma-Aldrich公司；4-硝基苯基月桂酸酯（p-ntrophenyllaurate，pNP Laurate） 東京化成工業(yè)株式會社；Triton X-100 北京索萊寶科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司；Synergy-2酶標儀 美國Biotek公司；Heidolph Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；EPED-E2-10 TH實驗室級超純水器 南京易普易達科技發(fā)展有限公司；V-1200型分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；F-7000型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茯磚茶多酚類物質(zhì)的制備及含量測定

稱取適量茯磚茶樣品，以1∶16（m/V）料液比加入超純水，在96 ℃恒溫水浴鍋中振蕩浸提40 min，取上清液[16]，茶渣用相同方法再次浸提，合并兩次上清液并抽濾去雜質(zhì)，濃縮、凍干，得到茯磚茶水浸提物。重復(fù)上述操作至得到茯磚茶上清液，加入聚酰胺樹脂，靜置吸附24 h，抽濾取樹脂，加入體積分數(shù)為80%的乙醇，解吸附24 h后抽濾，取液體并濃縮、凍干，得茯磚茶多酚類物質(zhì)。

總多酚含量采用Folin-酚法[17-18]測定。以747 nm波長處的吸光度為縱坐標，質(zhì)量濃度（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）為橫坐標繪制沒食子酸標準曲線回歸方程為：y＝10.276x+0.019 7（R2＝0.998 7）。

1.3.2 胰脂肪酶活性測定及茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制作用分析

胰脂肪酶活性的測定參照Gordon等[19]的方法并稍作改進。在具塞試管中加入pH 8.2的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）350 μL、胰脂肪酶150 μL、樣品溶液50 μL，37 ℃條件下預(yù)熱10 min后加入450 μL pNP Laurate底物，混勻，于37 ℃條件下避光反應(yīng)120 min，16 000 r/min離心3 min，405 nm波長處測定上清液的吸光度。對照組用緩沖液代替樣品液，每組實驗重復(fù)3 次。

采用上述實驗方法，改變茯磚茶多酚類物質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），測定各反應(yīng)的吸光度，根據(jù)公式（1）計算各樣品的抑制率。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制抑制曲線，進行多元非線性擬合，再利用回歸方程求出茯磚茶多酚類物質(zhì)樣品的半抑制濃度（IC50）?？瞻讓φ战M采用PBS緩沖液替代，所有實驗重復(fù)3 次。

式中：A1、A2分別為空白對照和不同樣品溶液在405 nm波長處的吸光度。

1.3.3 茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶抑制類型的確定

在半抑制濃度條件下，加入不同質(zhì)量濃度梯度的酶溶液，參考1.3.2節(jié)方法進行反應(yīng)測定反應(yīng)的吸光度，確定反應(yīng)速率；固定抑制劑及酶的質(zhì)量濃度，改變底物溶液的質(zhì)量濃度，得出一系列吸光度。按Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標，反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）為縱坐標，繪制雙倒數(shù)曲線圖，確定其動力學(xué)特征及其最大反應(yīng)速率（Vmax）、米氏親和常數(shù)（Km）和解離常數(shù)（Ki）。對照組采用緩沖溶液替代，每組實驗重復(fù)3 次。

茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制常數(shù)通過公式（2）進行計算：

式中：ρ為抑制劑的質(zhì)量濃度／（mg/mL），而α通過公式（3）進行確定。

式中：Vmax是沒有加入抑制劑的最大反應(yīng)速率/（mg/（mL·min））；是加入抑制劑的最大反應(yīng)速率/（mg/（mL·min））。

1.3.4 熒光猝滅實驗

在20 ℃、pH 6.9條件下，固定發(fā)射波長（λem）為250～500 nm，激發(fā)波長（λex）為200～400 nm[20]，用熒光分光光度計分別掃描酶溶液、PBS和樣品的3D熒光光譜圖，然后在相同條件下，將一定質(zhì)量濃度的多酚類物質(zhì)樣品溶液加入到酶溶液中，反應(yīng)1 min后進行3D熒光光譜掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制作用

經(jīng)測定，茯磚茶水浸提物和茯磚茶多酚的總多酚含量分別為25.8%和50.7%。該結(jié)果表明聚酰胺樹脂吸附分離法能有效除去茯磚茶水浸提物中的雜質(zhì)，可以從茶湯中分離吸附多酚類物質(zhì)[21-23]，提高樣品中多酚類物質(zhì)的含量。

傅冬和等[24]研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶不同萃取物對胰脂肪酶活性的影響程度不同，三氯甲烷萃取物有抑制作用，而水浸提物、乙酸乙酯及正丁醇萃取物有激活作用。由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，抑制劑質(zhì)量濃度越大，抑制效果越好，而且抑制率曲線隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增大而趨于平緩，說明茯磚茶多酚對胰脂肪酶最終總體表現(xiàn)為抑制作用。進行多元非線性擬合，可以得到茯磚茶多酚對胰脂肪酶的半抑制濃度（IC50）為0.81 mg/mL（表1）。據(jù)報道，茶多酚對胰脂肪酶的IC50為1.16 mg/mL[10]，霍世欣等[25]發(fā)現(xiàn)荷葉黃酮化合物對胰脂肪酶的IC50為0.007 6 mg/mL。因此茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制效果比普通市售茶多酚和荷葉黃酮化合物要差。本實驗得到的是茯磚茶多酚類物質(zhì)，其有效活性單體物質(zhì)的抑制作用有待進一步研究。

圖1 茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of Fuzhuan brick tea polyphenols on pancreatic lipase

表1 茯磚茶多酚類物質(zhì)的半抑制濃度及動力學(xué)參數(shù)Table 1 Half inhibitory concentration and kinetic parameters of Fuzhuan brick tea polyphenols

2.2 茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制類型

根據(jù)抑制劑與酶結(jié)合的方式和特點不同，抑制類型可分為可逆抑制和不可逆抑制兩種類型。由圖2可知，當反應(yīng)體系中有茯磚茶多酚類物質(zhì)抑制劑存在時，其速率直線通過原點（誤差允許范圍內(nèi)），由此可推斷茯磚茶多酚類物質(zhì)作為抑制劑對胰脂肪酶的抑制類型為可逆性抑制，與黃芩苷和米胚芽中物質(zhì)的抑制類型相似[26-27]。

圖2 茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制類型Fig.2 Inhibition type of Fuzhuan brick dark tea polyphenols on pancreatic lipase

可逆性抑制分為競爭性、非競爭性、反競爭性抑制3 種類型。在確定抑制機理時，利用Lineweaver-Burk的雙倒數(shù)法作圖，分別繪制抑制劑組和無抑制劑組的雙倒數(shù)曲線圖，確定兩條直線的交點。由圖3可知，兩直線交于橫軸，因此判斷該反應(yīng)的抑制類型為非競爭性抑制。并通過計算得出茯磚茶多酚類物質(zhì)的Vmax、Km、Ki值（表1）。

圖3 茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶的可逆性抑制雙倒數(shù)圖Fig.3 Lineweaver-Burk plot of reversible inhibition of Fuzhuan brick tea polyphenols on pancreatic lipase

2.3 茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶熒光光譜的猝滅效應(yīng)

圖4 胰脂肪酶、PBS、抑制劑和不同質(zhì)量濃度茯磚茶總多酚-酶混合物的3D熒光掃描Fig.4 Three-dimensional fluorescence spectra of pancreatic lipase mixture with PBS, inhibitor and Fuzhuan brick tea polyphenols at various concentrations

蛋白質(zhì)中由于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的存在使其具有內(nèi)源熒光，并在發(fā)射波長和激發(fā)波長為340 nm和280 nm處有最大熒光峰[20]。Trp、Tyr以及Phe因為其側(cè)鏈生色基團的不同而有不同的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，所產(chǎn)生熒光的強度和位置與這些殘基所處的微環(huán)境密切相關(guān)[28-29]。通過對酶、PBS、抑制劑三者3D熒光掃描（見圖4A～4C），結(jié)果表明PBS和抑制劑在測定范圍內(nèi)沒有熒光值，不會造成干擾。由圖4D～4G可知，當加入茯磚茶多酚類物質(zhì)樣品后，熒光光譜發(fā)生了猝滅，且隨著茯磚茶多酚類物質(zhì)樣品質(zhì)量濃度的增加，對胰脂肪酶的猝滅作用也增強，說明茯磚茶多酚類物質(zhì)樣品對酶蛋白所處的微環(huán)境產(chǎn)生了影響。Soares等[30]發(fā)現(xiàn)，酶為多疇結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)域可以形成小空穴和縫隙。茯磚茶多酚類物質(zhì)樣品對酶蛋白所處微環(huán)境產(chǎn)生影響的原因可能是茶葉中的小分子物質(zhì)兒茶素可以進入酶的空穴和縫隙與之結(jié)合，從而引起酶結(jié)構(gòu)的改變，影響其催化效果。

3 結(jié) 論

本研究制備了茯磚茶多酚類物質(zhì)并探究了其對胰脂肪酶的抑制作用，結(jié)果表明茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶有抑制作用，半抑制濃度（IC50）為0.81 mg/mL，抑制類型為可逆非競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki為2.56 mg/mL。熒光猝滅實驗表明茯磚茶多酚類物質(zhì)能夠引起胰脂肪酶的熒光光譜發(fā)生猝滅，酶蛋白所處的微環(huán)境有所變化，從而導(dǎo)致酶活性降低。

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Inhibitory Activity of Polyphenols from Fuzhuan Brick Tea on Pancreatic Lipase

LIU Tiannan, XU Mengjia, HU Bing, FEI Qunqin, XU Donglan, ZENG Xiaoxiong*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Polyphenols from Fuzhuan brick tea were obtained through hot water extraction and resin adsorption-separation process, and their inhibitory effect on pancreatic lipase was investigated by using enzyme kinetic analysis and fluorescence quenching method. The results showed that the polyphenols from Fuzhuan brick tea had inhibitory activity on pancreatic lipase with half inhibitory concentration (IC50) of 0.81 mg/mL. The inhibition was a type of reversible non-competitive inhibition, and the constant of inhibition (Ki) was 2.56 mg/mL. The fluorescence quenching analysis showed that the polyphenols had quenching effect on pancreatic lipase, and they reduced the enzyme activity, possibly by changing its structure due to their bonding to pancreatic lipase.

Fuzhuan brick tea; polyphenol; pancreatic lipase; inhibition activity

TS272；TS201.3

A

1002-6630（2015）21-0046-04

10.7506/spkx1002-6630-201521010

2015-06-16

2013年江蘇省科技支撐計劃項目（BE2013313）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）

劉天囡（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：2014808107@njau.edu.cn

*通信作者：曾曉雄（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：zengxx@njau.edu.cn