朱文燈 張 倩 吳 翠 霍艷萍 凌 婭*

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222047）

HPLC法測定板藍(lán)根顆粒中RS-告伊春的含量

朱文燈 張 倩 吳 翠 霍艷萍 凌 婭*

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222047）

目的建立板藍(lán)根顆粒中RS-告伊春含量測定方法。方法采用高效液相色譜法，Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸（6∶94），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為245 nm。結(jié)果RS-告伊春在1.94～30.98 μg/mL范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系（r=0.9997），定量限為7.12 ng/mL，回收率為96.1%，RSD為1.6%(n=9)。結(jié)論本方法快速、準(zhǔn)確。方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可作為板藍(lán)根顆粒質(zhì)量分析控制方法。

板藍(lán)根顆粒；RS-告伊春；高效液相色譜

板藍(lán)根顆粒由板藍(lán)根提取精制而成，具有清熱解毒，涼血利咽的功效，用于肺胃熱盛所致的咽喉腫痛、口咽干燥[1]。板藍(lán)根顆粒是《中國藥典》2010年版一部收載品種[2]，僅收載了理化鑒別和檢查項(xiàng)?，F(xiàn)代藥理研究表明：RS-告依春具有明顯的抗流感病毒作用[3]，為加強(qiáng)本品內(nèi)在質(zhì)量控制，增加板藍(lán)根顆粒中RS-告伊春的含量測定，同時(shí)對(duì)方法中供試品制備的提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間、提取溶劑用量均進(jìn)行了考察[4-5]，制定了本品中的RS-告伊春含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Agilent 1200高效液相色譜儀，紫外檢測器，所用軟件為ChemStation色譜工作站。Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)，Satorius ME5電子分析天平，KQ-250DV超聲波清洗儀，電熱恒溫水浴鍋。

1.2 試藥：板藍(lán)根顆粒（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格為3克/袋，批號(hào)120301、120302、120303、120801、120802、121001、121101、121102）；RS-告伊春對(duì)照品，購自中國食品藥品檢定研究院（供含量測定用，批號(hào)為111753-201304）；乙腈（色譜純，美國天地公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.01%磷酸（6∶94）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：245 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按RS-告伊春峰計(jì)算不低于4000。見圖1。

3 提取方法的考察

采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取方法，考察提取溶劑A、提取時(shí)間B、提取方法C及溶劑用量D，4個(gè)因素對(duì)提取結(jié)果的影響。因素水平見表1。L9（34）正交表設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

從極差R值可以看出，影響提取的因素：提取溶劑A＞提取方法C＞溶劑用量D＞提取時(shí)間B；各因素的最有水平組合為A1C2D2B2。對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行方差分析見表3，從方差分析結(jié)果可以看出，影響因素提取溶劑A最具有顯著性，影響因素順序?yàn)椋禾崛∪軇〢＞提取方法C＞溶劑用量D＞提取時(shí)間B；各因素最優(yōu)水平組合為A1C2D2B2，與直觀分析結(jié)果一致。最終確定提取方案為：50 mL的水，超聲處理60 min。

4 溶液的制備

4.1 對(duì)照品溶液的制備：取RS-告伊春對(duì)照品約10 mg，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

4.2 供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）60 min，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

5 線性關(guān)系考察

精密稱取RS-告伊春對(duì)照品適量，制得一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（濃度為30.98 μg/mL）。將儲(chǔ)備液分別稀釋成濃度為1.94 μg/mL、3.87 μg/mL、7.74 μg/mL、15.49 μg/mL、30.98 μg/mL的溶液，分別進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=63.873X-0.5311，r=0.9997結(jié)果表明RS-告伊春在1.94～30.98 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。按信噪比（S/N）為10∶1計(jì)算，RS-告伊春的定量限為7.12 ng/mL。

6 精密度試驗(yàn)

精密吸取RS-告伊春對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算RSD值為0.41%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

7 重復(fù)性試驗(yàn)

圖1 RS-告伊春對(duì)照品（A）、板藍(lán)根顆粒樣品（B）HPLC色譜圖

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 方差分析結(jié)果

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

取同一供試品（批號(hào)為120301），按4.2制備供試品溶液，平行制備6份，測定，結(jié)果RS-告伊春的平均含量為0.62mg/袋，RSD=1.5%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

8 中間精密度試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)為120301），按4.2制備供試品溶液，由兩位分析人員于不同時(shí)間分別制備6份供試品并分別使用兩臺(tái)儀器測定，計(jì)算RSD值為1.6%，結(jié)果表明該方法中間精密度良好。

9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)為120301），按4.2制備供試品溶液，分別在第0、1、2、4、6、8、12、16 h進(jìn)行測定，計(jì)算峰面積RSD為0.3%，結(jié)果表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

10 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)120301，RS-告伊春含量：0.62毫克/袋）9份，每份5 g，分別按80%、100%和120%加入對(duì)照品，按4.2制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定，計(jì)算加樣回收率，見表4。試驗(yàn)結(jié)果表明，平均回收率為96.1%，RSD為1.6%。

11 樣品測定

取8批樣品，按4.2制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，計(jì)算，結(jié)果見表5。

表2 L9（34）正交表設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 樣品測定結(jié)果（n=2）

12 討 論

12.1 色譜條件耐用性考察：本文對(duì)不同品牌色譜柱、不同柱溫和不同流動(dòng)相比例進(jìn)行了考察，結(jié)果表明本文采用的色譜條件耐用性良好。

12.2 測定波長的選擇及色譜峰純度驗(yàn)證：根據(jù)RS-告伊春的全波長紫外吸收光譜，選擇245 nm作為RS-告伊春測定波長，經(jīng)試驗(yàn)在此波長下，供試品色譜中RS-告伊春與其他雜質(zhì)峰達(dá)到很好的分離。

12.3 板藍(lán)根顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無對(duì)RS-告伊春素含量測定的方法，本實(shí)驗(yàn)建立的方法操作簡單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為板藍(lán)根顆粒質(zhì)量控制依據(jù)。

[1]崔田,張祖亮.高效液相色譜法測定板藍(lán)根顆粒中表告依春含量[J].中國藥業(yè),2012,21(8):50-51.

[2]國家藥典委員會(huì).中國藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[3]安益強(qiáng),賈曉斌,陳彥,等.HPLC-DAD法測定板藍(lán)根藥材及其制劑中主要抗病毒生物堿含量[J].中成藥,2009,31(5):733-736.

[4]莫迎.不同提取方法對(duì)板藍(lán)根中(R,S)-告依春的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2011,17(6):89-91.

[5]王瑞,楊海英,楊琪偉,等.板藍(lán)根的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中草藥,2010, 41(3):478-450.

Determination of RS-Goitrin in Isatidis Radix Granula by HPLC

ZHU Wen-deng, ZHANG Qian, WU Cui, HUO Yan-Ping, LING Ya*
(Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222047, China)

ObjectiveTo establish the determination method of RS-Goitrin in isatidis radix granula.MethodsUsing high performance liquid chromatography (HPLC) method, Kromasil C18chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 5μm), mobile phase of acetonitrile-0.01% phosphoric acid (6∶94), the velocity 1.0 mL/min, column temperature 30 ℃, detection wavelength of 250 nm.ResultsPuerarin in sample quantity is 1.94～30.98 μg/mL range, show a good linear relationship (r=0.9997). Quantitative limit of 7.12 ng/mL, the recovery was 96.1%, RSD was 1.6% (n=9).ConclusionThis method is rapid and accurate. The stability of the method, good repeatability, and can be used for isatidis radix granula quality control are analyzed.

Isatidis radix granula; RS-Goitrin; High performance liquid chromatography (HPLC)

R282.710.3

B

1671-8194（2015）06-0051-02