沙日娜

(包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭，014035)

金針菇(Flammulina velutipes(Fr.)Singer)，又名金錢菌，屬真菌門(Eumycophyta)，擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱 (Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，口磨科(Tricholomataceae)，小火焰菌屬(Flammulina)或金錢菌屬(Collybia)。金針菇口味鮮美，營養(yǎng)豐富，富含多種生物活性物質(zhì)，如多糖、維生素、蛋白質(zhì)、多元酚、樸菇素、膳食纖維等。近年來的研究表明，金針菇提取物具有免疫調(diào)節(jié)［1-2］、降膽固醇［3］、抑制腫瘤生長［4-6］等多種生理功能，但是其功效關(guān)系尚不清楚，其中金針菇多糖被認為是重要的功能因子之一。本研究對金針菇胞外多糖通過DEAE-52纖維素柱和G-100葡聚糖進行分離純化，分別研究了FEPS-1和FEPS-2的分子量、單糖組成、鍵型和抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試菌種:金針菇(Flammulina velutipes)，內(nèi)蒙古農(nóng)科院保存。

深層液體種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，VB10.1 g，水 1 L，pH自然。

液體種子培養(yǎng)條件:25℃恒溫搖床160 r/min振蕩培養(yǎng)10 d。

深層液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，VB10.1 g，蛋白胨3 g，酵母粉 3 g，水 1 L，pH 自然。

深層液體發(fā)酵培養(yǎng)條件:100 L氣升式液體深層發(fā)酵罐中培養(yǎng)14 d，發(fā)酵溫度25℃，連續(xù)通入無菌空氣。

30%H2O2，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;體積分數(shù)為95%的乙醇，天津市百世化工有限公司;DPPH，Sigma公司;DEAE-52纖維素，Sigma公司;葡聚糖G-100，Sigma公司;苯酚天津市天大化學(xué)試劑廠;濃H2SO4，淄博化學(xué)試劑廠有限公司;濃HCl，淄博化學(xué)試劑廠有限公司;三氯乙酸，天津大茂化學(xué)試劑廠。

752-N紫外可見分光光度計，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;GC2010氣相色譜儀，日本津島公司;TDL-5-A型臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;Nicolet380傅立葉變換紅外光譜儀，美國熱電集團;Nicolet380傅立葉變換紅外光譜儀，美國熱電集團;DK-S24型恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;LXJ-68-02型離心機，北京醫(yī)療儀器修理廠;DZF-6021型真空干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 多糖的提取

首先對發(fā)酵液進行濃縮，濃縮溫度為75℃，然后利用醇沉法提取金針菇胞外多糖。

1.3 成分含量測定

總糖含量采用苯酚-硫酸法［7］測定。

1.4 多糖的凝膠柱層析

首先采用DEAE-纖維素離子交換柱對多糖進行分離純化，用濃度梯度為0.2，0.5，1.0 mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫速度控制在1 mL/min，每個洗脫梯度收集25管，每管收集2 mL，利用苯酚-硫酸法測定收集到的多糖溶液濃度，繪制洗脫曲線。然后葡聚糖G-100凝膠柱對多糖進行進一步分離純化和純度鑒定［8］。用0.1 mol/L NaCl溶液充分平衡層析柱后，用蒸餾水作為洗脫劑，洗脫速度控制在0.1 mL/min，每管收集2 mL，同樣利用硫酸-苯酚法對收集到的多糖溶液濃度測定，繪制洗脫曲線。

1.5 多糖的分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠滲透色譜法(HPLC)對多糖的分子質(zhì)量進行測定［9］。用高效液相色譜儀(1260，Agilent Technologies，USA)，SHODEX SB-806HQ 色譜柱column(8.0 mm ×300 mm)及示差折光檢測器測定。流動相為0.2 mol/L NaCl溶液，進樣量為100 μL，流速為0.5 mL/min，柱溫保持在5℃。標準品及樣品質(zhì)量濃度均為2 mg/mL。用葡聚糖系列樣品作為標準品，以lgMw(分子質(zhì)量對數(shù))對ET(保留時間)繪制標準曲線，得線性回歸方程:lgMw=1-0.342 9ET+11.975，R2=0.999 1。用 0.2 mol/L NaCl水溶液將樣品配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，上柱測定其保留時間，根據(jù)回歸方程計算分子質(zhì)量。

1.6 構(gòu)成糖分析

糖樣品經(jīng)過酸加熱完全水解(0.25 mol/L H2SO4，100 ℃，16 h)，或者不經(jīng)過水解處理，按照Blakeney［10］等制備成各單糖的全乙?；谴佳苌?，然后進行氣相色譜(GC)分析(島津 GC-14C，柱溫210℃，N2流速30 mL/min)，分離柱為島津公司的毛細管柱DB-1(0.25 mm×30 m)。

1.7 多糖的紅外光譜(IR)分析

多糖的 IR分析儀采用 Perkin Elmer公司的Spectrun GXFT-IR紅外光譜分析系統(tǒng)。樣品采用KBr壓片法進行測定。

1.8 多糖的體外抗氧化分析

多糖對DPPH自由基的清除率測定反應(yīng)體系如下:2 mL體積分數(shù)為95%的乙醇或DPPH(0.1 μmol/L)，2 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液(100～1 000 mg/L)。反應(yīng)混合物在25℃水浴15 min，在517 nm處測定吸光度［11］。清除羥基自由基的測定方法是采用Smironff(1989)的方法［12］。多糖還原力的測定方法根據(jù) Oyaizu(1986)的方法［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇多糖的組分分離純化

采用DEAE-纖維素柱對FEPS進行組分分離，分別利用蒸餾水和 0.2，0.3，0.5，1.0 mol/L 的 NaCl溶液作為流動相對FEPS洗脫，得到2個組分，如圖1所示。FEPS分離得到FEPS-1和FEPS-2兩個組分。對經(jīng)過DEAE-纖維素分離得到的2個組分用葡聚糖G-100凝膠做進一步分離，如圖2所示。FEPS-1和FEPS-2均分離得到一個單一的洗脫峰，表明FEPS-1和FEPS-2均為純多糖。對FEPS-1和FEPS-2進行紫外光譜掃描(ultravialet spectrum，UV)，試驗結(jié)果顯示FEPS-1和FEPS-2在280 nm處有特征吸收峰，表明兩種組分可能是以糖蛋白的形式存在。

圖1 FEPS的DEAE-纖維素離子交換柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of FEPS on DEAE-celluose collumn

圖2 兩種多糖組分的葡聚糖G-100凝膠層析洗脫曲線(A)FEPS-1和(B)FEPS-2Fig.2 The profile of G-100 gel filtration chromatography by two polysaccharides(A)FEPS-1 and(B)FEPS-2

2.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

由圖3通過計算得知，F(xiàn)EPS的重均分子質(zhì)量(Mw)為3.64×104Da，數(shù)均分子質(zhì)量(Mn)為1.56×104Da，黏均分子質(zhì)量(Mv)為3.28 ×104Da，Z 均分子質(zhì)量(Mz)為7.14×104Da，峰位分子質(zhì)量(Mp)為1.16×104Da。FEPS的Mw/Mn值為2.33。

圖3 FEPS高效液相色譜圖分析Fig.3 HPLC spectra of FEPS

如圖4所示FEPS-1的Mw為5.53×104Da，Mn為2.41×104Da，Mv為4.99×104Da，Mz為1.11×105Da，Mp為1.23×104Da。FEPS-1的Mw/Mn值為2.29。

圖4 FEPS-1高效液相色譜圖分析Fig.4 HPLC spectra of FEPS-1

由圖5可知，F(xiàn)EPS-2的Mw為1.36×104Da，Mn為1.05×104Da，Mv為3.55×104Da，Mz為1.20×105Da，Mp為1.14×104Da。FEPS-2的Mw/Mn值為1.29。

圖5 FEPS-2高效液相色譜圖分析Fig.5 HPLC spectra of FEPS-2

根據(jù)標樣的保留時間來測定單糖的含量，由表1可知，F(xiàn)EPS-1主要由鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖，其含量分別為28.51%，62.94%，2.08%和6.47%，對應(yīng)的摩爾比為 15.7∶31.3∶1.1∶3.3，由此可以看出，F(xiàn)EPS-1含量最多的單糖是葡萄糖和鼠李糖。FEPS-2主要由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖組成，含量分別是68.23%，21.48%和10.29%，相應(yīng)的摩爾比為37.5∶10.8∶5.2。可以看出 FEPS-2含量最多的單糖也是葡萄糖和鼠李糖。

表1 氣相色譜結(jié)果Table 1 Results of gas chromatograph

如圖6所示，胞外多糖的兩個組分(FEPS-1和FEPS-2)的紅外光譜分析，兩個組分在3 600～3 200 cm-1附近有較強的羥基(—OH)伸縮振動吸收峰［14］。FEPS-1在1 650.74 cm-1處的吸收峰說明有氮氫鍵(N—H)的存在［15］。FEPS-1 和 FEPS-2 分別在865.69 cm-1和880.72 cm-1處的吸收峰，表明它們的多糖結(jié)構(gòu)中存在呋喃環(huán)［16］。

2.3 兩種組分的體外抗氧化活性

2.3.1 FEPS-1和FEPS-2對DPPH的清除作用

圖7表明，F(xiàn)EPS-1和FEPS-2清除DPPH的能力是隨多糖濃度的升高而增大，在濃度為100 μg/mL時，F(xiàn)EPS-2對DPPH的清除率為(73.67±1.65)%。據(jù)報道，當質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，香菇多糖對DPPH的清除率為15%，靈芝多糖對DPPH的清除率為15%［17］。FEPS-2的EC50為(53±0.02)μg/mL遠遠高于香菇多糖(400 μg/mL)［18］和靈芝多糖(1 000 μg/mL)［17］。結(jié)果表明，F(xiàn)EPS-2對DPPH具有較高的清除率。

圖6 FEPS-1和FEPS-2的紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectra of FEPS-1和FEPS-2

圖7 FEPS-1和FEPS-2對DPPH的清除作用Fig.7 Scavenging effects of FEPs-1 and FEPs-2 on DPPH radicals

2.3.2 FEPS-1和FEPS-2對羥基自由基的清除作用

FEPS-1和FEPS-2對羥基自由基的清除作用見圖8。在100 μg/mL時 FEPS-1和 FEPS-2對羥基自由基的清除率分別為(12.51±1.02)%和(69.94±4.81)%，F(xiàn)EPS-2對羥基自由基的清除作用是靈芝多糖［17］的2.41 倍，香菇多糖［18］的2.59 倍，白靈菇多糖［21］的 1.77 倍。

圖8 FEPS-1和FEPS-2對羥基自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of FEPs-1 and FEPs-2 on hydroxyl radicals

2.3.3 FEPS-1和FEPS-2的還原力測定

如圖9所示，在100 μg/mL時，F(xiàn)EPS-1和FEPS-2在700 nm處測得的還原力分別為(0.23±0.04)和(0.41 ±0.02)，F(xiàn)EPS-2的還原力比香菇高0.06，比白靈菇、金針菇、美味牛肝菌分別高 0.36，0.24，0.23［22］。說明2種組分都具有非常強的還原力，F(xiàn)EPS-2的還原力更為顯著。

圖9 FEPS-1和FEPS-2還原力測定Fig.9 Scavenging effects of FEPS-1 and FEPS-2 on DPPH radicals

3 結(jié)論

在本試驗中，經(jīng)過DEAE-纖維素離子交換柱和葡聚糖G-100凝膠柱的分離，F(xiàn)EPS分離得到多糖組分分別為FEPS-1和FEPS-2。利用氣相色譜法測定了FEPS-1和FEPS-2單糖的組成。FEPS-1主要由鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖，F(xiàn)EPS-2主要由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖組成。FEPS和FEPS-2中鼠李糖和葡萄糖含量都比較高。在結(jié)構(gòu)分析中，通過紅外光譜法對FEPS-1、GRPS-2在4 000～400 cm-1區(qū)段進行掃描，結(jié)果顯示，兩者均為含有呋喃環(huán)的多糖。

自由基是人體生命過程中生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，體內(nèi)自由基過多或清除緩慢均會引起分子、細胞甚至器官損傷，導(dǎo)致病變。結(jié)果表明，金針菇胞外多糖組分具有直接清除羥基自由基和DPPH的能力，且清除能力與多糖的濃度呈正相關(guān)，隨多糖濃度的提高，F(xiàn)EPS-2清除率可達到70%以上。此外兩者均有較強的還原力。

［1］ Hsu H C，Hsu C I，Lin R H，et al.Fip-vvo，a new fungal immunomodulatoryprotein isolated fromVolvariellavolvacea［J］.Biochem，1997，323(2):557-565.

［2］ Hsieh K Y，Hsu C L，Lin J Y，et al.Oral administration of an ediblemushroom-derived protein inhibits the development of food-allergic reactions in mice［J］.Clinic Experimental Allergy，2003，33(11):595-565.

［3］ 魏華，謝俊杰，吳凌偉，等。金針菇營養(yǎng)保健作用［J］。天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9(2):93-96.

［4］ 孔祥輝，孫宇峰，任永春，等.金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的研發(fā)與應(yīng)用［J］。生物技術(shù)，2006，16(4):85-88.

［5］ Leung M Y，F(xiàn)ung K P，Choy Y M.The isolation and characterization of animmunomodulatory and anti-tumor polysaccharide preparation from Flammulina velutipes［J］.Immunopharmacology，1997，35(3):255-263.

［6］ WANG H X，Ng T B.Flammulin:a novel ribosome-activating protein from fruiting bodies of the winter mushroom Flammulina velutipes［J］.Biochem Cell Bio，2000，78(16):699-702.

［7］ Gilles D M，Hamilton K A，Rebers J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Anal Chem，1956，28(3):350-356.

［8］ 王博，徐莎，黃琳娟，等。白芨多糖BSPI-A的分離純化及結(jié)構(gòu)研究［J］。食品科學(xué)，2010，31(7):120-123.

［9］ LIN H J，QIN X M，Aizawa I，et al.Chemical properties of water-soluble pectins in hot-and cold-break tomato pastes［J］.Food Chemistry，2005，93(3):409-415.

［10］ Blakeney A B，Harris P T，Henry R J，et al.A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis［J］.Carbohydrate Res，1983，113(83):219-299.

［11］ LIU X H，F(xiàn)ENG P Y，SHI Y L.Study of isolation and purification of polysaccharides from fresh mycelia of Agaricus blazei Mussill and its anti-fatigue effect［J］.Journal of Southwest Agricultural University，2006，28(2):190-194.

［12］ Smirnoff N，Cumbes Q J.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes［J］.Phytochemistry，1989，28(4):1 057-1 060.

［13］ Oyaizu M.Antioxidative activity of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin layer chromatography［J］.J Jpn Soc Food Sci，1986，35:771-775.

［14］ CAI Wei-rong，XIE Liang-liang，CHEN Yong，et al.Purification，characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea［J］.Carbohydrate Polymers，2013，92(2):1 086-1 090.

［15］ GAN D，MA L，JIANG C，et al.Production，preliminary characterization and antitumor activity in vitro of polysaccharides from the mycelium of Pholiota dinghuensis Bi［J］.Carbohydrate Polymers，2011，84(3):997-1003.

［16］ CHEN Y，MAO W J，Wang B F，et al.Preparation and characterization of an extracellular polysaccharide produced by the deep-sea fungus Penicillium griseofulvum［J］.Bioresource Technology，2013，132(3):178-181.

［17］ LI Z P，WU P，WU S Q.Study on antioxidant activity of Ganoderma applanatum intracellular polysaccharides［J］.Sci Technol Food Ind，2010，31(6):108-110.

［18］ Turlo J，Gutkowska B，Herold F.Effect of selenium enrichment on antioxidant activities and chemical composition of Lentinula edodes(Berk.)Pegl.mycelial extracts［J］.Food Chem，Toxicol，2010，48(4):1 085-1 091.

［19］ ZHANG J，ZHANG Z C，WANG Y H.Studies on water soluble polysaccharides from the mycelia of Ganoderma lucidum by alkaline extraction［J］.J Food Sci Biotechnol，2005，3(24):98-100.

［20］ 尹艷麗，王金榮，胡元森，等。香菇·靈芝菌絲體多糖的提取及復(fù)合抗氧化活性研究［J］。安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(18):9 521-9 522，9 530.

［21］ 馬淑鳳，陳麗梅，徐化能，等.白靈菇胞外多糖的分離純化及其抗氧化活性的研究［J］。江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，26:157-162。.

［22］ 陳欣，龔蘭，劉冠卉。食用真菌多糖提取條件的優(yōu)化及其還原力的比較［J］。食品科學(xué)，2010，31(14):140-144。